论文部分内容阅读
目的:应用噬菌体展示随机12肽库技术筛选可以与华支睾吸虫病人混合血清特异性结合的华支睾吸虫模拟抗原表位,分析其序列、结构特点及免疫活性,探讨应用华支睾吸虫模拟抗原表位检测华支睾吸虫病人血清的可行性。
方法:(1)用饱和硫酸铵盐析法提取华支睾吸虫病人混合血清IgG,Lawry 法测定蛋白浓度,SDS-PAGE鉴定IgG的纯度,斑点免疫金银染色(dot-IGSS)检测纯化IgG的活性。(2)用纯化IgG对噬菌体展示随机12肽库进行3轮亲和筛选。(3)ELISA法检测第三轮筛选后随机挑选的噬菌体单克隆的免疫活性并予以扩增。(4)依ELISA的检测结果挑选免疫活性较高的克隆进行序列分析及免疫学鉴定。(5)Western blot检测各阳性噬菌体单克隆展示的表位类型。
结果:(1)经过纯化后收集到免疫球蛋白,Lowry法测定其浓度为5.3mg/ml,SDS-PAGE电泳未见杂带,达到电泳纯,纯化IgG与华支睾吸虫成虫抗原斑点免疫金银染色反应结果为强阳性。(2)经3轮筛选,噬菌体的回收率逐轮上升,说明筛选中所获得的噬菌体克隆有较高程度的富集。(3)随机挑选的20个单个噬菌斑的扩增液,ELISA检测其中12个为阳性,从中挑取6个免疫活性较高的克隆(P1~P6)进行的DNA序列分析,得到6个DNA序列。(4)斑点免疫金银染色检测6个克隆有3个可被华支睾吸虫病人血清识别(P1~P3)。(5)用ELISA法对华支睾吸虫模拟抗原表位和华支睾吸虫成虫抗原(CsA)进行比较实验,显示这6个模拟抗原表位特异性及敏感性与CsA相比无显著性差异(P>0.05)。(6)Western blot显示6个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫病人混合血清IgG反应,展示的是线性表位。
结论:(1)应用噬菌体展示肽库筛选技术可以获得华支睾吸虫抗原模拟表位。
(2)噬菌体展示肽库筛选的华支睾吸虫模拟抗原表位与CsA有相同或相似的抗原性。