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本课题通过药剂学、高分子材料学、药理学、分子生物学等手段的交叉应用,首先以聚酰胺-胺树枝状聚合物(Polyamidoamine dendrimer, PAMAM)为聚合物骨架材料,以聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)为高分子修饰剂,制备不同PEG化程度的PEG-PAMAM,然后将模型药物阿霉素(Doxorubicin, DOX)通过酸敏感的顺式乌头酸酐(Cis-acotonic anhydride, CA)和非酸敏感的丁二酸酐(Succinic anhydride)共价结合到PAMAM表面,制备PEG-PAMAM-DOX偶联物纳米载药系统,通过考察PEG化程度和DOX偶联方式对载药系统体内外活性的影响,优选出PEG化程度最高的,并通过顺式乌头酸酐偶联DOX的PPCD 32/1作进一步研究。为进一步提高PPCD的抗肿瘤活性,以相同分子量的双功能PEG(MAL-PEG-NHS)代替单功能PEG,通过控制投料比制备与PPCD 32/1的PEG化程度和载药量相近的主动靶向给药系统RGD-PPCD,考察偶联RGD多肽对PPCD的体内外活性的影响,并探讨其可能的机理。第一章的主要内容是PEG-PAMAM-DOX的合成和表征。首先以分子量为5000的MeO-PEG-NHS和4代PAMAM为起始原料,制备三种PEG化程度的PEG-PAMAM,分别为PEG-PAMAM 4/1、16/1和32/1。通过1H-NMR峰面积归一化法计算得到每个PAMAM分子表面共价结合了3.8、12.9和20.1个PEG分子。分别采用TLC、UV、1H-NMR、FTIR、GPC等方法对三种PEG-PAMAM进行结构确证和表征。接着通过酸酐的氨解反应分别制备DOX的顺式乌头酸酐衍生物(CAD)和丁二酸酐衍生物(SAD),两者经过活化后分别与三种PEG化程度的PEG-PAMAM偶联,制备PPCD和PPSD。采用UV和GPC等方法对PPCD和PPSD(统称PEG-PAMAM-DOX)进行表征,并测定粒径和Zeta电位。各PEG-PAMAM-DOX的载药量在6.18-18.18%(wt.%),每个PAMAM分子表面偶联约14个DOX分子,游离CAD/SAD的含量小于0.6%(mol%),粒径均在纳米级的范围内,Zeta电位随PEG化程度增加而降低,且PPSD的电位高于PPCD。第二章对PEG-PAMAM-DOX的体内外活性进行评价。酸敏感释放实验表明PPCD具有酸敏感特性,DOX的释放程度和速度均随着PEG化程度的增加以及pH值的降低而增加,PPSD则在各pH条件下均没有DOX释放；以Cathespin B模拟溶酶体的酶环境,释放结果表明PPCD和PPSD均不能通过酶解释放游离DOX。各PEG-PAMAM和PEG-PAMAM-DOX的溶血毒性均显著降低。以SKOV-3和B16细胞为肿瘤细胞模型,PPCD对两种细胞的毒性高于PPSD,且PPCD的细胞毒性随PEG化程度的增加而增加。两种细胞对PPCD和PPSD的摄取均随PEG化程度的增加而降低。SKOV-3细胞对PEG-PAMAM-DOX的摄取机理研究结果表明PEG-PAMAM-DOX主要通过与细胞膜上的负电荷发生静电相互作用,然后经网格蛋白介导的内吞摄取。细胞内分布研究证明了PPCD能在溶酶体酸性环境中释放游离DOX进入细胞核,PPSD虽然也定位于溶酶体,但不能释药。第二章的第二节进一步考察了各PEG-PAMAM-DOX的组织分布和药效学。首先采用活体荧光成像实验初步考察各PEG-PAMAM-DOX在荷SKOV-3肿瘤组织的分布,结果发现肿瘤蓄积随PEG化程度的增加而增加,PPSD的蓄积高于PPCD。采用FLD-HPLC法测定在各组织中游离和结合的DOX浓度。DOX与PEG-PAMAM偶联后,在血液中的滞留时间显著延长,主要表现为AUC, T1/2β和MRT显著增加,Vc和CL大大减小；组织分布特性也发生显著改变,以总DOX计,PPSD 4/1、PPSD 16/1、PPSD 32/1、PPCD 4/1、PPCD 16/1和PPCD 32/1在肿瘤部位的AUC分别为DOX溶液剂组的16.6、51.4、75.8、11.6、21.9和37.5倍。以游离DOX计,PPCD在肿瘤部位AUC大于PPSD, PPCD 32/1和16/1的游离DOX的AUC大于DOX溶液剂组,分别达到35.0和15.5h·μg/g。各PEG-PAMAM-DOX均能有效抑制肿瘤生长,延长小鼠的生存时间,其中PPCD 32/1具有最强的抗肿瘤活性,接种21天后的抑瘤率达到87.4%,平均生存时间和中位生存期最长,生存期延长率最大。第三章对抗肿瘤活性最大的PPCD32/1进一步用RGD多肽修饰,制备主动靶向载药系统。首先通过分子模拟的方法对所设计的环状多肽RGDyC的受体亲和力进行评估；在此基础上通过双功能的MAL-PEG-NHS分别偶联靶向头基RGDyC和载体PAMAM,制备RGD-PEG-PAMAM；最后将CAD偶联到PAMAM表面得到RGD-PPCD。表征结果表明,RGD-PPCD中每个PAMAM分子表面偶联有21.2个PEG分子、16.8个RGDyC分子和14.2个CAD分子,粒径为17.02±0.13nm, Zeta电位为2.31±0.15mV。RGD-PPCD与PPCD具有相近的PEG化程度、载药摩尔数、粒径和Zeta电位,可用于进一步研究考察偶联RGD对PPCD体内外活性的影响。第四章评价了RGD-PPCD的体内外活性。体外释放研究证明了偶联RGD对酸敏性几乎没有影响。以人脐静脉内皮细胞HUVEC作为肿瘤新生血管内皮模型,SKOV-3和B16细胞为肿瘤细胞模型,进行细胞水平的研究。偶联RGD进一步增强了PPCD对三种细胞的毒性,HUVEC、SKOV-3和B16细胞的IC50值分别从8.24μM、20.58μM和15.64μM降低至3.58μM、11.04μM和4.37μM。与PPCD相比,HUVEC细胞对RGD-PPCD的总摄取增加了1.57倍；SKOV-3细胞的总摄取和内吞分别增加了1.32倍和1.58倍；B16细胞的总摄取和内吞分别增加了1.38倍和1.85倍。摄取机理研究结果表明,RGD-PPCD主要通过非特异性的静电相互作用和特异性的整合素αvβ3与RGD多肽相互识别与三种细胞接触,然后主要经网格蛋白介导的内吞被细胞摄取,内吞过程均为肌动蛋白和微管蛋白参与的细胞运动,此外,RGD与整合素αvp3形成的配体受体复合物也对内吞起到促进作用。对RGD-PPCD的细胞内定位研究结果表明,三种细胞摄取RGD-PPCD后均能将其递送至溶酶体,且RGD-PPCD能在溶酶体的弱酸性条件下释放游离DOX,进入细胞核。采用活体荧光成像考察RGD-PPCD在SKOV-3荷瘤裸鼠的组织分布,48h后RGD-PPCD在肿瘤组织的荧光强度为PPCD的1.52倍(P<0.05),游离的RGDyK能显著降低RGD-PPCD在肿瘤部位的荧光强度(P<0.05),证实了RGD-PPCD在肿瘤蓄积的特异性。B16荷瘤小鼠的体内药动学实验结果表明,RGD-PPCD的滞留时间比PPCD稍短。RGD-PPCD在肿瘤组织总DOX和游离DOX的AUC分别是PPCD的1.46倍和2.36倍；另一方面,RGD-PPCD除了能引起肿瘤细胞凋亡外,还能显著引起肿瘤新生血管内皮细胞的凋亡,以上因素的综合作用可能使RGD-PPCD比PPCD具有更高的抗肿瘤活性,平均生存时间,中位生存期和生存期延长率相应增加。HE染色和TUNEL法的结果表明,RGD-PPCD相对于DOX溶液剂表现出良好的安全性,没有心脏毒性,对其他正常组织也几乎无损伤。