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乳及乳制品营养丰富,是人类重要的基础食物,羊乳和牛乳作为目前市面上常见的两种乳源,因其价格、产量等差异而常有羊乳中掺入低价牛乳的情况发生。为了维护市场公平,促进行业健康发展,羊乳制品的掺假鉴别检测显得至关重要。本课题根据牛羊乳的DNA差异,分别以牛、羊的线粒体12S rRNA为靶基因设计两对特异性引物,建立了几种牛羊乳区别检验的快速、低成本PCR检测方法技术,其研究内容及结果如下:牛羊乳DNA提取方法及常规双重PCR方法研究。比较了用于鲜乳中DNA提取的有机溶剂法、快速DNA试剂盒法和磁珠法,以提取的DNA为模板和牛羊特异性引物进行双重PCR,扩增出了牛和羊目标DNA片段分别为256 bp、326 bp,优化建立了基于凝胶电泳的双重PCR方法用于牛羊乳的区别检验。通过对三种方法DNA片段的完整性鉴定及PCR扩增的电泳结果表明,有机溶剂法对乳中DNA提取效率低;快速DNA试剂盒法获得的乳DNA纯度较好,但重复性较差;磁珠法提取的DNA纯度和效率高,且重复性好,用染料法间接测得羊乳和牛乳提取得到DNA的浓度分别为2.132μg/mL和1.186μg/mL。双重PCR结果显示:DNA试剂盒法能检测出羊乳中掺入牛乳的比例为10%,而磁珠法的检出阈值则能达到1%。因此,后续的实验研究均采用磁珠法提取样品DNA。羊乳中掺入牛乳的单重荧光定量PCR检测方法研究。为了克服常规PCR电泳分析耗时长、样品通量低、容易污染的局限,建立了基于DNA结合染料（SYBR Green I）的荧光定量PCR方法,用于羊乳制品中牛乳成分的掺假鉴别检测。牛、羊模板DNA分别加入牛、羊引物（分别为153 bp和118 bp）进行荧光定量PCR扩增,利用扩增曲线的Ct值对牛羊乳进行区分,并对PCR相关参数的优化。结果表明,对牛羊乳DNA进行梯度稀释扩增后,反应可分别达到10-5和10-4的灵敏度,经线性拟合得,R2分别为0.995和0.996,扩增效率及重复性良好;该方法最低可检出新鲜羊奶中掺入2.5%的牛乳成分,并成功应用于11份市售羊乳制品样本中的牛、羊源性成分的鉴别。羊乳中掺入牛乳的双重荧光定量PCR检测方法研究。为了进一步能够在提高样品通量的同时,节省样品和试剂,降低检测成本,建立了基于EvaGreen染料的双重荧光定量PCR法。在模板DNA中同时加入牛羊两对特异性引物,优化条件,利用扩增产物DNA熔解曲线的Tm值不同来检测羊乳中牛乳成分。熔解曲线分析显示,牛和羊特异性产物的Tm值分别为79℃和82℃,并且通过比较SYBR Green I染料与EvaGreen染料可知,EvaGreen染料能显著提高熔解曲线的分辨率,使得羊乳中掺入牛乳的最低检测限值低至为0.05%,并应用于市售乳制品掺假检测。基于钌配合物染料的荧光定量PCR方法探究。SYBR Green I和EvaGreen因受专利保护、结构信息难获取和成本较高的进口商品化试剂,为此,以化学结构明晰的Ru配合物为DNA结合染料,与乳DNA结合后应用到实时荧光定量PCR中的检测方法进行初步探究。实验结果显示,通过实时监测钌配合物染料的荧光信号变化可获得用于定量的PCR扩增曲线,由对牛羊乳DNA梯度稀释及拟合得出,在Ru作用下DNA具有良好的线性关系,其R2分别为0.974和0.986,且检测灵敏度与SYBR Green I和EvaGreen相当,有望开发成为一种适用于荧光定量PCR应用的新型检测试剂。综上所述,本研究通过对普通PCR、荧光定量PCR的单重及双重的乳制品掺假检测方法建立,进而对以钌配合物为染料的荧光定量PCR检测技术作初步探究。相较以蛋白质、脂肪等为检测目标的方法,本研究基于DNA建立的牛羊乳区别检验的几种PCR方法,具有结果可靠、易操作、高通量等优点,可以为乳制品的掺假检验方法提供技术参考。此外,已建立的方法具有一定的通用性,可进一步推广应用于肉制品、水产品及油脂制品等的真实性检测,从而对判定食品标签标识的真实性及对食品监管方面也有一定的借鉴作用。