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孔雀石绿（Malachite Green，MG）化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25ClN2，又名碱性绿、孔雀绿或者中国绿，属三苯甲烷类染料，孔雀石绿在水生动物体内会很快代谢成无色孔雀石绿。孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿成为重大的食品安全隐患。目前，孔雀石绿被我国被列为禁用渔药，世界其他各国，1992年加拿大就已经禁止孔雀石绿及无色孔雀石绿作为渔场杀菌剂；美国政府给出了严格的规定，禁止在食用水产品中检出孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿；2002年6月，欧盟政府颁布了相关法令，禁止在任何渔场中违禁使用孔雀石绿。2002年5月，中国政府将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止孔雀石绿用于所有食品动物的养殖及运输过程。尤其是无色孔雀石绿，其与孔雀石绿相比在水产品中的残留量更多，残留时间较更长，因此，建立水产品中无色孔雀石绿的快速检测技术已刻不容缓具有更加重要的意义。目前无色孔雀石绿的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）等。这些方法操作繁琐、仪器价格昂贵，需要专业的技术人员，而且不适合现场大规模的检测。以免疫学方法为基础的快速检测方法，具有快速、灵敏、价格低廉、适合现场大规模检测等优点，是目前公认最适合作为药物残留检测的快速筛选方法之一。酶联免疫检测试剂盒作为一种快速、灵敏、不需要任何仪器的检测技术可作为无色孔雀石绿的药物残留现场检测的一种重要的初筛手段。本实验通过合成无色孔雀石绿的人工抗原，免疫Balb/c小鼠后，通过采集免疫小鼠的脾脏细胞，利用杂交瘤实验技术制备了可用于检测无色孔雀石绿的单克隆抗体，并利用得到的特异性强的单克隆抗体制备了无色孔雀石绿的酶联免疫检测试剂盒。首先，利用混酸硝化还原法对无色孔雀石绿进行改造，获得氨基无色孔雀石绿（NH2-LMG）；同时，采用结构类似物副品红（PA）,然后采用改进的碳二亚胺（carbodiimide）法制备了2种不同无色孔雀石绿完全抗原记作LMG-BSA和PA-BSA，通过紫外分光光度计扫描、聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳、质谱分析等方法对无色孔雀石绿完全抗原LMG-BSA和PA-BSA进行鉴定。结果表明：紫外扫描都发现了峰的漂移；PA-BSA偶联物质谱图中可观察到分子量为78180的高分子化合物。对比BSA的分子量和PA的分子量，可以判断偶联成功且偶联比率约为37:1，LMG-BSA偶联物质谱图中可观察到分子量为68759的高分子化合物。对比BSA的分子量和NH2-LMG的分子量，可以判断偶联成功且偶联比率约为7:1，利用LMG-BSA和PA-BSA免疫小鼠，得到的血清效价均为105以上，表明制备得到的LMG-BSA和PA-BSA偶联物均可以用于孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿人工抗原的制备。将LMG-BSA和PA-BSA偶联物分别免疫5只小白鼠，加强免疫后获得多抗血清，分别采用LMG-OVA和PA-OVA作为包被原进行血清效价测定，结果表明各抗体血清的效价均高于105。实验中选取血清效价最高的BALB/C小鼠用于细胞融合。采用杂交瘤技术将脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。然后采用间接ELISA以及间接竞争ELISA法对杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，同时利用有限稀释法进行3次亚克隆，最终筛选出4株稳定的可分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，LMG-BSA免疫获得两株分别是B8、D5，PA-BSA免疫获得两株分别是E9和H-6。最后通过腹水大量制备单克隆抗体，采用饱和过硫酸铵法纯化获得单克隆抗体。对单克隆抗体的特性鉴定结果表明：这四株单克隆抗体的亲和力能达到108L/mol，均属于高亲和力的单克隆抗体，通过建立标准曲线，四株单克隆抗体B8、D5、E9和H6的最低检测限分别为5.61μ g/L、3.98μ g/L、4.62μ g/L和12.04μ g/L，均属于高灵敏的抗体；同时单克隆抗体的特异性良好，均可用于检测水产品中无色孔雀石绿残留的酶联免疫试剂盒的开发。本实验采用过碘酸钠法，对实验合成的完全人工抗原PA-BSA进行了辣根过氧化物酶的标记，成功的制备得到了辣根过氧化物酶标记PA-BSA，通过紫外分光光度计和ELISA实验实际操作，对制备得到的HRP酶标记抗原进行了鉴定，实验鉴定的结果表明，HRP酶标记抗原的效果良好，可用于ELISA试剂盒的建立。以辣根过氧化物酶标记的完全抗原为基础，成功的建立了酶联免疫检测试剂盒，并对其检测性能进行测定，在实验室建立前处理条件下，该酶联免疫检测试剂盒最低检测限为370ng/L，能够用于水产品中无色孔雀石绿的残留检测。综上，本实验制备的无色孔雀石绿酶联免疫试剂盒可用于水产品中无色孔雀石绿药物残留的现场检测。