论文一肿瘤坏死因子TNFα抑制胶原合酶限速亚单位P4Hα1的作用及其分子机制的实验研究1.背景:动脉粥样硬化斑块不稳定所导致的斑块破裂和血栓形成是引起急性心脑血管事件的主要原因。研究发现典型的易损斑块具有以下特点:较大的脂核、较薄的纤维帽、斑块胶原纤维和平滑肌细胞含量减少、巨噬细胞密度和活性增加、活化T细胞浸润增加等,其中斑块胶原的过度降解是导致斑块不稳定的主要原因,因此斑块内胶原的代谢平衡已成为近年来心血管病基础研究的热点之一。动脉粥样硬化斑块纤维帽的完整性和高强度主要有赖于细胞外基质的支持,其中最主要的成分是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原纤维。胶原代谢主要由胶原的合成与降解平衡来调节。此外,胶原纤维的三维结构也是影响其功能的因素之一。分布在动脉内膜的血管平滑肌细胞是粥样斑块内胶原的主要来源。斑块内胶原的代谢失调如胶原合成减少和/或降解增加均可导致斑块表面的纤维帽变薄和斑块的不稳定。因此,明确斑块的细胞外基质代谢及其调节机制对于稳定斑块具有重要的意义。胶原蛋白的生物学合成过程包括一系列的前骨胶原的翻译后修饰,其中细胞修饰过程需要5种酶的参与,包括3种胶原羟化酶和2种胶原糖基转移酶。在这些羟化酶中,4羟基-脯氨酸羟化酶（P4H）是一个具有2个α亚基（P4Hα1,P4Hα2）和2个β亚基（P4Hβ1,P4Hβ2）的四聚体。其中β亚基是二硫化异构酶,起催化作用的主要部位存在于β亚基,而α亚基的主要作用是决定酶的活性,是胶原合成的重要限速酶。P4H是在所有的已知21种类型胶原合成过程中起关键作用的酶。P4H的过表达会导致胶原的合成增多,而抑制P4H的产生则可导致胶原的不稳定和降解。炎症在许多心血管疾病的发生和发展过程中都起着重要的作用,如动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌病和动脉瘤等。在急性冠状动脉综合征（ACS）的发病过程中,炎症是斑块易损和破裂的始动环节。炎症可以诱导多种细胞因子的分泌,如肿瘤坏死因子（TNFα）、转录生长因子（TGF-β）以及各种白细胞介素等,这些细胞因子可通过激活基质金属蛋白酶（MMP）和抑制胶原合成引起细胞外基质的降解。在这些因子中,TNFα由激活的巨噬细胞所分泌,在细胞外基质降解和ACS的发病过程中起着非常重要的作用。2.目的:（1）在体外试验中,研究肿瘤坏死因子（TNFα）对胶原酶限速亚单位P4Hα1的抑制作用。（2）在体外试验中,探讨TNFα对P4Hα1抑制作用的分子机制,为稳定易损斑块寻找新的治疗靶点。3.方法:3.1质粒构建pGL3-baisc多克隆载体被用来构建包含P4Hα1启动子片断的质粒。我们首先应用带有KpnⅠ和HindⅢ内切酶双酶切位点,并含有P4Hα1启动子片断的引物对P4Hα1启动子进行扩增。我们选取了-580bp至+76bp这一部分的启动子序列,采用逐段删除的方法,对引物进行设计,最后得到了包含9段P4Hα1启动子片断,顺序依次为:-580至+76bp、-480至+76bp、-417至+76bp、-320至+76bp、-271至+76bp、-184至+76bp、-145至+76bp、-97至+76bp、-32至+76bp、+18至+76bp的pGL3-P4Hα1载体。3.2对细胞的转染与刺激在剂量实验中,0 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml和100 ng/ml TNFα纯品被分别加入到细胞培养基中,在时间实验中,我们在4小时,8小时,24小时和48小时,分别向培养基中加入100 ng/ml TNFα,与培养基充分混匀后进行检测。将1 ug含有P4Hα1启动子片断的pGL3-baisc质粒转染进平滑肌细胞中,进行下一步检测。为了检测细胞因子在TNFα对P4Hα1抑制过程中所起的作用,我们设计了因子NonO、hnRNP-K、BUB3、ILF2、DJ-1和HIF1等的RNA干扰片断,将siRNA转染入细胞进行检测。3.3 RT-PCR通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对平滑肌细胞内P4Hα1,β-actin,luciferase等的mRNA进行检测。3.4 EMSA将探针与细胞核蛋白混合,用抗体标记后进行凝胶电泳,观察探针与蛋白的结合能力。3.5 ChIP分析将抗目的蛋白的抗体与核蛋白结合后,用含有目的片段的引物进行PCR扩增,观察目的蛋白与目的DNA片段的结合能力。3.6 Western Blot经过提取蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗和二抗,曝光等步骤观察目的蛋白的表达。4.结果:4.1.TNFα对P4Hα1的抑制作用我们用100ng/ml TNFα分别刺激平滑肌细胞4,8,24和48小时后,提取细胞RNA,检测P4Hα1mRNA的表达水平。发现经TNFα刺激8小时后,P4Hα1mRNA产量明显下降。用1ng/ml,10ng/ml和100ng/ml TNFα刺激平滑肌细胞8小时,观测P4Hα1mRNA的表达,发现随着TNFα浓度的升高,P4Hα1的mRNA水平呈递减趋势,在100ng/ml达到最大的抑制效应。4.2.P4Hα1启动子上TNFα反应元件（TaRE）的鉴定我们用脂质体转染的方式将含有P4Hα1启动子片断的PGL3 Basic载体转入平滑肌细胞中,经TNFα刺激后,用RT-PCR的方法检测PGL3 Basic载体上荧光素酶的表达。发现转染了含有+18至+76bp启动子片断的载体后,超过80%的TNFα的抑制作用消失,荧光素酶表达基本恢复正常,证明TNFα反应元件位于P4Hα1启动子-32至+18片断上,TNFα通过作用于这一片断抑制P4Hα1的mRNA表达。4.3.NonO与P4Hα1启动子的结合在EMSA中,我们将平滑肌细胞核蛋白与含有-32至+18片断的探针结合后,用抗NonO抗体标记,在经TNFα刺激后,Supershift条带显著增强,证明NonO在TNFα刺激后,与P4Hα1启动子的结合力增强。在平滑肌细胞核蛋白中,用抗NonO抗体免疫共沉淀下与NonO结合的DNA片段,用包含P4Hα1启动子-32至+18片断的引物进行PCR扩增后,发现只有经TNFα刺激后,NonO蛋白才能与P4Hα1启动子结合,从而扩增出清晰的PCR条带。将NonOsiRNA转入平滑肌细胞后,经TNFα刺激,用RT-PCR检测P4Hα1mRNA的表达。发现敲低NonO蛋白后,60%以上的TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用消失。4.4.TNFα通过下游通路ASK1和JNK实现对P4Hα1的抑制作用TNFα刺激平滑肌细胞前,先用JNK抑制剂-SP600125刺激平滑肌细胞1小时阻断JNK通路,观测P4Hα1mRNA的表达。发现加入JNK抑制剂后,TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用基本消失。ASK1抑制剂-Thioredoxin刺激平滑肌细胞1小时后,继续用TNFα刺激8小时,RT-PCR检测P4Hα1的mRNA水平变化,发现ASK1抑制剂几乎全部消除了TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用。4.5.DJ-1在TNFα对P4Hα1抑制过程中的作用我们将DJ-1siRNA转入平滑肌细胞中沉默DJ-1基因,经TNFα刺激后,观察P4Hα1mRNA的表达。结果显示DJ-1基因沉默消除了超过50%的TNFα对P4Hα1的抑制作用。将DJ-1siRNA转入平滑肌细胞中,并分别用TNFα和JNK1腺病毒刺激细胞,用抗NonO抗体免疫共沉淀后用含有P4Hα1启动子TaRE片段的引物PCR扩增,发现经TNFα或JNK1刺激都不能扩增出PCR片段,证明DJ-1RNA干扰后,NonO与TaRE不再结合。我们进一步将NonOsiRNA转入平滑肌细胞,用TNFα或JNK1腺病毒刺激后,用抗DJ-1抗体进行ChIP分析,发现不仅将NonO敲低后,DJ-1不能与TaRE结合,而且在没有转染NonOsiRNA的细胞中,TNFα或JNK1也都不能导致DJ-1与TaRE的结合。进一步用抗氧化DJ-1抗体进行ChIP分析,发现TNFα和JNK1均可使氧化DJ-1与TaRE结合,在将NonO基因沉默后,这种结合力明显下降。4.6.TNFα导致的组蛋白改变平滑肌细胞经TNFα或JNK1腺病毒刺激后,提取核蛋白,用抗组蛋白4第12个赖氨酸的抗体进行ChIP分析。结果显示,经TNFα刺激后,组蛋白4第12个赖氨酸的乙酰化明显增强。平滑肌细胞经TNFα或JNK1腺病毒刺激后,用抗组蛋白3第9个赖氨酸的抗体和包含P4Hα1启动子TaRE片段的引物进行ChIP分析。发现TNFα刺激后,组蛋白3第9个赖氨酸的去乙酰化明显增强。用20uMHATI刺激平滑肌细胞24小时,提取核蛋白,用抗NonO抗体进行ChIP分析后发现,不能扩增出PCR片段,证明经HATI刺激后,NonO不能再与P4Hα1启动子片段结合。经TSA刺激后,用抗NonO抗体免疫共沉淀NonO蛋白后,经ChIP分析,发现TSA对NonO与TaRE片段的结合并不能产生影响。用NonOsiRNA敲低NonO蛋白后,用抗组蛋白4第12个赖氨酸乙酰化抗体进行ChIP分析,结果显示组蛋白4第12个赖氨酸乙酰化没有变化,NonO的RNA干扰不能影响其乙酰化过程。经TNFα或JNK1刺激后,用抗组蛋白3第9个赖氨酸乙酰化抗体进行ChIP分析,发现扩增出了PCR片段,证明NonO的RNA干扰影响了组蛋白3第9个赖氨酸的构型,使其由去乙酰化变成乙酰化。5.结论:（1）TNF-α通过作用于P4Hα1启动子上的反应元件,激活ASK1-MKK4-JNK1-NonO信号通路,使转录因子DJ-1氧化和转录因子NonO磷酸化,实现对P4Hα1的抑制作用。（2）这些结果揭示了炎症因子引起胶原降解的关键分子,对于减少斑块纤维帽的胶原降解、稳定易损斑块、抑制主动脉瘤的形成,提供了具有重要学术意义和潜在应用价值的治疗新靶点。论文二动脉粥样硬化斑块中精氨酸酶Ⅱ表达水平和调控机制的实验研究1.背景近年来,由动脉粥样硬化（AS）导致的心脑血管疾病已成为世界许多国家第一位致死性疾病。研究证明,在AS的长期病程中,血管内皮功能异常是最早可检出的异常,在多项临床试验中,高频血管超声技术所测量的肱动脉内皮功能异常已被作为预测急性心脑血管事件的替代终点。由内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric-oxide synthase,eNOS）所介导的一氧化氮（NO）的产生是血管内皮功能的最重要调节因素。NO具有扩张血管的直接作用,并可通过激活下游通路,抑制血小板粘附和聚集、血管平滑肌细胞的增殖和迁移以及内皮细胞表达黏附分子,从而起到抗AS的作用。已有研究表明,NO合成的减少会导致血管内皮功能的失调,继而促进AS病变或诱发心脑血管事件。大量的基础和临床研究已证明由eNOS所介导的NO的产生对于AS的发生和发展起着关键的作用。目前,文献中已报告3种类型的一氧化氮合酶,第一种一氧化氮合酶首先在大脑中被分离出来,故称为神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxidesynthase,nNOS）,但其后在多种细胞包括血管内皮细胞中发现了nNOS的表达;第二种一氧化氮合酶首先从巨噬细胞中被分离出来,称为诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）;第三种一氧化氮合酶首先在主动脉内皮细胞中被发现,故称为内皮型一氧化氮合酶（eNOS）。在这三种一氧化氮合酶中,eNOS对于血管功能的调节最为重要。eNOS可被内皮细胞中的一些信号传导分子所激活,eNOS的构型变化尤其是磷酸化改变会直接影响eNOS的活性。左旋精氨酸是一个参与许多病理过程的半必需氨基酸,可被催化成为左旋脯氨酸、左旋鸟氨酸以及多聚氨酸,同时也是NO合酶的作用底物。在血管内皮细胞中,经eNOS作用后,左旋精氨酸转化为左旋瓜氨酸和NO,是NO的前体物质。由于NO在维持内皮功能中的关键作用和左旋精氨酸在NO合成中的重要地位,近年来一些学者对左旋精氨酸的血管保护作用进行了研究,结果表明左旋精氨酸-eNOS-NO通路参与AS的发生和发展过程。动物实验的结果证实,左旋精氨酸治疗可降低AS病变的发生率。精氨酸酶是一种尘物锰金属酶,可催化左旋精氨酸水解为左旋鸟氨酸和尿素。精氨酸酶有两个60%同源序列的同功异构体—精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ,它们在组织中的表达和细胞中的定位均不相同。精氨酸酶Ⅰ在肝脏内大量表达,并调节着体内大部分精氨酸酶的活性。精氨酸酶Ⅱ则在大部分组织中都有表达,尤其是肾脏和前列腺,但在肝脏中含量很少。最近的研究表明,在主动脉、肺动脉、颈动脉和冠状动脉等血管组织中,精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的含量都很丰富。由于精氨酸酶有水解左旋精氨酸为左旋鸟氨酸和尿素的生物学功能,因此可与eNOS竞争分解左旋精氨酸,使左旋精氨酸向NO的转化减少。在巨噬细胞中对精氨酸的代谢过程的研究发现,左旋精氨酸向尿素的转化要多于向NO的转化,在动物体内抑制了精氨酸酶的表达后,NO的产量明显增高,在内皮细胞中的实验也证实抑制了精氨酸酶后,可刺激NO的合成。另外,精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的过表达在降低左旋精氨酸水平的同时,也显著抑制了NO的含量。在精氨酸酶的两个同功异构体中,精氨酸酶Ⅱ与AS的关系更为密切。在人动脉内皮细胞中,针对精氨酸酶Ⅱ的RNA干扰降低了Ox-LDL对精氨酸酶的上调程度,增加了NO的表达。在ApoE基因敲除小鼠的主动脉早期AS病变中,精氨酸酶Ⅱ活性升高,NO水平降低。但这些研究主要局限于AS早期病变,随着斑块负荷的增大,精氨酸酶Ⅱ表达水平是否持续升高,eNOS表达水平是否持续下降,二者之间的关系如何,尚不清楚。因此,对于AS晚期病变,精氨酸酶Ⅱ能否作为敏感的生化标记物和有效的干预靶点是一个悬而未决的问题。此外,调节精氨酸酶Ⅱ的转录过程迄今不明,能否在启动子和转录因子水平抑制精氨酸酶Ⅱ的合成成为另一个悬而未决的问题。2.目的（1）在放置颈动脉狭窄套管的ApoE基因敲除小鼠中,建立斑块负荷较大的颈动脉AS模型,检测斑块内精氨酸酶Ⅱ和eNOS的表达水平。（2）寻找精氨酸酶Ⅱ的启动子活性片断以及与精氨酸酶Ⅱ启动子结合的转录因子,明确精氨酸酶Ⅱ的转录过程。3.方法3.1.质粒构建pGL3-baisc多克隆载体被用来构建包含精氨酸酶Ⅱ启动子片断的质粒。我们首先应用带有XhoⅠ和HindⅢ内切酶双酶切位点,并含有精氨酸酶Ⅱ启动子片断的引物对精氨酸酶Ⅱ启动子进行扩增。然后经PCR扩增、目的片断与载体的连接后构建pGL3-精氨酸酶Ⅱ启动子质粒。3.2.apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的建立80只雄性apoE-/-小鼠均全程高脂饲料喂养（0.25%胆固醇+15%脂肪）,并行颈动脉套管术,以诱发颈总动脉粥样硬化病变,喂养8周后提取斑块组织进行检测。3.3.细胞培养人HELA细胞和内皮细胞经原代培养和细胞传代后进行实验研究。3.4.免疫组化经漂洗,封闭,一抗和二抗孵育后测量NO,eNOS和精氨酸酶Ⅱ等因子在斑块的含量3.5.RT-PCR经RNA提取,逆转录和RT-PCR等步骤检测精氨酸酶启动子片断的活性。4.结果4.1.组织学检测4.1.1.HE染色HE染色发现,小鼠右侧颈总动脉狭窄套管内出现较大的斑块,斑块内膜和中膜面积明显增大,左侧颈总动脉无斑块生成。4.1.2.Masson染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中的胶原含量丰富。4.1.3.天狼猩红染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原纤维均明显增多。4.1.4.油红0染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中脂质成分明显增多。4.2.eNOS在斑块组织中的表达用免疫组化的方法检测了eNOS在ApoE-/-小鼠双侧颈总动脉中的蛋白表达,发现apoE-/-小鼠右颈总动脉的eNOS蛋白表达水平显著低于左侧。4.3.精氨酸酶Ⅱ在斑块组织中的表达通过免疫组化观察精氨酸酶Ⅱ在斑块中的表达后,发现与左侧颈总动脉相比,右颈颈总动脉斑块内的精氨酸酶Ⅱ蛋白表达水平明显升高。4.4.精氨酸酶Ⅱ启动子片断活性的检测我们将包含精氨酸酶Ⅱ启动子片段的质粒转入HELA细胞中,24小时后,用RT-PCR的方法观察荧光素酶的表达。发现启动子-704bp至-644bp片断承担了大部分的精氨酸酶Ⅱ启动子活性。4.5.与精氨酸酶Ⅱ启动子结合的转录因子的鉴定我们设计了包含精氨酸酶Ⅱ启动子-704bp至-644bp片断的生物素标记探针。用免疫共沉淀的方法沉淀下与探针结合的蛋白,经凝胶电泳后和考马斯亮蓝染色,切下清晰的条带后,进行质谱分析,发现了与精氨酸酶Ⅱ启动子片断结合的蛋白PARP1、PSPC1和SFPQ。5.结论（1）在斑块负荷较大的AS病变中,精氨酸酶Ⅱ的蛋白表达水平明显升高而eNOS蛋白表达水平明显降低。PARP1、PSPC1和SFPQ等转录因子结合于精氨酸酶Ⅱ启动子的活性区域,参与调节精氨酸酶Ⅱ的转录过程。（2）这些结果提示精氨酸酶Ⅱ可作为AS的生化标记物和干预靶点,通过高效、特异地抑制精氨酸酶Ⅱ的合成,可增强eNOS的活性和改善血管内皮功能,具有重要的学术意义和潜在的应用价值。论文三ACE2基因转染抑制早期动脉粥样硬化病变及其分子机制的实验研究1.背景近年来的研究认为,AS发生的始动环节是血管内皮细胞（VEC）损伤,VEC损伤后可表达粘附分子,后者可使单核细胞与血管内皮细胞相互粘附,继而在趋化因子的作用下,使单核细胞与T-淋巴细胞迁移入内膜下组织,然后单核细胞转变为巨噬细胞并吞噬脂质形成单核源性泡沫细胞,同时产生一系列炎症和免疫反应,从而促进AS的形成。单核细胞趋化因子（MCP-1）是一种强有力的趋化因子,主要作用是促进单核细胞聚集于内膜下,在AS的形成中起重要作用。近年研究还发现,在人类内皮细胞上有一种能够结合Ox-LDL的受体,称之为植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（Lectin like Ox-LDL Receptor-1,LOX-1）,LOX-1的激活进一步诱导了粘附分子的产生,导致内皮细胞功能的损伤。LOX-1的表达是VEC出现功能异常的早期标志,在AS的形成中起重要作用。因此,深入研究MCP-1、LOX-1等炎症因子和内皮细胞功能的变化,对明确AS早期病变的发生机制和防治措施至关重要。传统的观念认为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS系统的主要成分,最近发现了这一系统的许多新成员,包括ACE2、Ang-（1-7）、Ang-（1-9）等,这些物质的发现和对其病理生理学意义的研究使人们对RAS有了许多新的认识。ACE2是近年来发现的第一个ACE的同系化合物,与ACE一样,ACE2也是一种含锌的金属蛋白酶,完整的人类ACE2蛋白由805个氨基酸组成。目前发现的ACE2的生理功能主要有两点:能够高效催化AngⅡ转化为Ang-（1-7）,这一途径的催化活性较ACE水解AngⅠ的催化活性高400倍。ACE2亦可使AngⅠ转化为Ang-（1-9）,后者还可以进一步被ACE或其他的酶继续降解成为Ang-（1-7）。研究发现Ang-（1-7）是一种有重要生物学作用的血管紧张素家族的终末活性产物,是AngⅡ的内源性拮抗因子,具有扩张血管、降低血压、抑制平滑肌细胞增殖、利尿、利钠及抑制血管新生内膜增生等多种功能。近年来,ACE2及其催化产物Ang-（1-7）与心血管病的关系日益受重视。研究发现,新西兰大白兔AS斑块中有大量ACE2蛋白的表达,主要分布在血管内皮细胞和泡沫细胞,提示ACE2与AS斑块的病理过程密切相关。急性心肌梗死（AMI）的大鼠中ACE2及ACE基因的表达明显增多,免疫组化研究发现ACE2蛋白主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞以及心肌细胞中。心力衰竭患者中心肌ACE2基因表达增多,ACE2过表达可抑制高血压大鼠的心肌纤维化,改善左室舒张功能,提示ACE2拮抗了ACE的功能。直接应用Ang-（1-7）还可改善急性心肌梗死的左室重构。这些研究提示ACE2过表达具有保护心血管的功能。通过增强ACE2的表达或直接应用Ang-（1-7）,可拮抗ACE的作用,对AS及心脑血管病的治疗可起到积极的作用,从而有望成为心脑血管病的一个治疗新靶点。然而,ACE2过表达对于早期AS病变的作用及其分子机制至今不明。2.目的（1）在体内研究中,观察ACE2过表达对AS早期病变的抑制作用。（2）在体内和体外研究中,探讨ACE2过表达抑制早期AS病变的分子机制。3.方法3.1.ACE2表达质粒—复制缺陷重组腺病毒质粒Ad5-ACE2的构建将质粒PMD18-T-ACE2进行酶切,然后构建穿梭质粒（pDC316—ACE2）。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组,形成重组腺病毒质粒,重组腺病毒质粒在HEK293细胞内包装成为复制缺陷重组腺病毒质粒Ad5-ACE2。2.2.ACE2基因治疗100只新西兰大白兔随机分为Ad-ACE2组（20只）、Ad-ACE2+A779组（20只）、Ad-EGFP组（20只）、单纯高脂对照组（20只）及单纯高脂对照+A779组（20只）。在所有实验兔中行腹主动脉内膜球囊损伤术并行4周高脂喂养,于4周末时开始基因治疗,向转染部位的管腔中分别注入滴度为2.5×10⁹pfu/mL的Ad-ACE2或Ad-EGFP。在Ad-ACE2+A779组,除进行ACE2基因治疗外,加用Ang-（1-7）受体拮抗剂A779,用药具体用法为:经颈静脉泵入,浓度为200 ngkg^-1 min^-1,用药28天。3.3.内皮细胞的ACE2腺病毒转染首先用Ang-Ⅱ(终浓度为10^-6M/L)刺激细胞24小时,更换培养基后将ACE2腺病毒载体和EGFP腺病毒载体按1×10⁶ pfu的浓度分别加入细胞培养基中,在ACE2基因转染24小时,48小时和72小时后提取细胞蛋白进行检测。用1×10⁶mol Ang-（1-7）加入到内皮细胞培养基中,充分混匀后于37℃培养箱放置,于4小时,8小时,16小时和24小时提取蛋白进行检测。3.4.质谱分析用质谱分析的方法测量AS病变组织中Ang-（1-7）/Ang-Ⅱ比值和Ang-Ⅰ/Ang-Ⅱ比值,分别反映ACE2和ACE的活性。3.5.血脂水平检测在实验开始、4周末和8周末抽取兔的血液样本,留取血清,用酶学检测血清胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。3.6.免疫组化检测经漂洗、封闭、一抗和二抗孵育后测量LOX-1、MCP-1、ERK、p38等因子在AS组织中的含量3.7.RT-PCR经RNA提取,逆转录和RT-PCR检测AS病变组织中ACE2的表达。3.8.Western Blot经凝胶电泳、转膜、加入一抗和二抗后检测AS病变组织中ACE2、ACE、AT1R、MCP-1、LOX-1等因子的蛋白表达水平。4.结果4.1.基因转染后ACE2的表达提取兔的斑块组织,发现与Ad-EGFP组,单纯高脂对照组和单纯高脂对照+A779组相比,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ACE2基因表达明显增高。用Western Blot的方法观察Ad-ACE2在细胞内的转染效率,发现与EGFP腺病毒转染组和对照组相比,ACE2的蛋白水平在腺病毒转染24小时后显著增高。4.2.ACE2基因转染对AS病变的影响通过对兔腹主动脉斑块的HE染色观察到,Ad-EGFP组、单纯高脂对照组、单纯高脂对照+A779组与Ad-ACE2组相比,AS病变的内膜面积显著增加,内膜与中膜面积比值增大。在加入了Ang-（1-7）受体拮抗剂-A779后,Ad-ACE2+A779组的内膜面积和内膜与中膜面积比值比Ad-ACE2组又明显增大。4.3.ACE2基因转染对MCP-1和LOX-1表达的影响以免疫组化方法检测斑块内MCP-1和LOX-1的蛋白表达,与Ad-ACE2组相比,Ad-EGFP组、单纯高脂对照组、单纯高脂对照+A779组中MCP-1和LOX-1蛋白表达水平升高。以ACE2腺病毒和A779刺激细胞后,用Western Blot观测MCP-1和LOX-1的蛋白水平,发现在ACE2腺病毒转染48小时后,与EGFP腺病毒转染组和对照组相比,MCP-1和LOX-1蛋白表达水平明显下降,但在加入A779后,发现ACE2对MCP-1和LOX-1表达的抑制作用了大部分被逆转。4.4.ACE2过表达对Ang-（1-7）蛋白表达的影响通过对腹主动脉斑块内Ang-（1-7）蛋白水平的检测发现,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的Ang-（1-7）表达高于Ad-EGFP组、对照组和A779组。ACE2基因转染24小时后,Ang-（1-7）蛋白水平与EGFP基因转染组和对照组相比明显升高。4.5.ACE2腺病毒转染对ACE表达的影响用免疫组化的方法对体内ACE蛋白表达水平的检测发现,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ACE表达明显低于Ad-EGFP组、对照组和A779组。Western Blot检测内皮细胞ACE表达后发现,在ACE2腺病毒转染细胞24小时后,与EGFP基因转染组和对照组相比,ACE蛋白表达水平明显降低。4.6.ACE2腺病毒转染对AT1R表达的影响对AS组织进行Western Blot分析,发现Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的AT1R蛋白表达水平明显低于Ad-EGFP组、对照组和A779组。提取细胞蛋白后,用Western Blot检测AT1R的表达水平,发现在ACE2腺病毒转染细胞48小时后,AT1R蛋白表达水平明显下降。4.7.ACE2腺病毒转染对ERK-p38表达的影响对AS组织进行免疫组化检测,发现Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ERK和p38蛋白表达比Ad-EGFP组、对照组和A779组显著降低。ACE2基因转染内皮细胞24小时后,与EGFP基因转染组和对照组相比,ERK和p38的蛋白表达水平明显下降。4.8.ACE2腺病毒转染PI3K-Akt表达的影响用Western Blot的方法观察了AS组织内PI3K和Akt通路的表达情况,结果显示,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的PI3K和Akt蛋白表达比Ad-EGFP组、对照组和A779组明显升高。ACE2腺病毒转染细胞24小时后,与Ad-EGFP组和对照组相比,PI3K和Akt蛋白表达水平明显升高。4.9.ACE2腺病毒转染对ROS表达的影响我们在细胞中对Ang-Ⅱ下游通路ROS的表达进行了观测,发现ACE2基因转染48小时后,与Ad-EGFP组和对照组相比,ROS蛋白表达水平显著下降。加入A779后,与Ad-ACE2组相比,Ad-ACE2+A779组ROS蛋白表达水平明显回升。5.结论（1）ACE2通过多条信号通路的交互对话实现对AS早期病变的显著抑制作用,这些通路包括:Ang-Ⅱ-AT1R-ERK-p38-ACE,Ang-Ⅱ-AT1R-ROS-MCP-1/LOX-1,Ang-Ⅱ-AT1R-PI3K-Akt-LOX-1/MCP-1,Ang-（1-7）-ERK-p38-ACE,Ang-（1-7）-PI3K-Akt-LOX-1/MCP-1和Ang-（1-7）-ROS-MCP-1/LOX-1等。（2）通过选择性增强或抑制Ang-Ⅱ和Ang-（1-7）信号通路的交互作用,有可能起到抑制AS早期病变的作用,这为AS的治疗提供了多个具有重要理论意义和潜在应用价者的新靶点。