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对于植物铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的表达及其与抗逆胁迫关系已得到证实,但有关甘蔗Cu/Zn-SOD基因的克隆、表达抗逆胁迫中作用的研究在国内外尚未见报道。在本研究中克隆出甘蔗Cu/Zn-SOD基因,并分析其序列特征,组织表达差异,以及在不同逆境胁迫下的表达模式。构建了该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中得到成功表达;构建了该基因的植物表达载体并转入野生型烟草,检测得到烟草转基因植株。为进一步研究该基因的生物学功能的及其与逆境胁迫的关系奠定了基础。主要结果如下:
1、根据NCBI数据库中与甘蔗同源性较高的禾本科植物的核苷酸序列,设计克隆该基因的上游简并引物,以甘蔗品种GT28叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,3SIDE引物为下游引物,PCR扩增得到Cu/Zn-SOD基因的全长,该序列全长为710 bp,包含启动子ATG和终止子GGC,GenBank登陆号为JQ958328。生物信息学分析表明,Cu/Zn-SOD蛋白的相对分子质量为15.1 kDa,等电点为5.71;其在铜锌超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高;进化树分析表明该基因的氨基酸序列与禾本科植物聚于同一进化分支。
2、根据克隆得到的Cu/Zn-SOD基因序列设计实时荧光定量PCR引物,以甘蔗品种GT28的根、茎、叶的cDNA为模板分析该基因的组织表达差异,结果表明该基因在叶片中表达量最大,茎中次之,根中很少。另外在聚乙二醇(PEG6000)、NaCl、低温(4℃)和H2O2四种外源胁迫下,研究该基因与逆境胁迫的关系,结果表明四种外源胁迫均诱导该基因的表达,表达的模式因调控机制的不同而异,推测其与甘蔗抵御渗透胁迫相关。
3、本研究构建了Cu/Zn-SOD基因的原核表达载体,在1.0 mmol.L-1的IPTG诱导下,在分子量约为22.0 kDa的位置上存在1条融合蛋白诱导表达的条带,与预计大小基本相符,表明该原核表达载体构建成功,无氨基酸错码或移位现象,为今后深入研究该基因的功能及抗体的制备奠定了基础。
4、本研究中构建了Cu/Zn-SOD基因的正反义植株表达载体,酶切和测序验证表明该载体构建正确。运用农杆菌介导的叶盘法转入烟草,经PCR检测获得转基因植株。这为以后研究该基因与逆境的关系及甘蔗抗逆育种奠定了基础。