气道高反应性(Bronchial Hyperresponsiveness, BHR)是指气道对正常不引起或仅引起轻度应答反应的特异性抗原刺激和非特异性刺激,出现过度反应,发生气道过度狭窄或支气管收缩。以气道高反应为主要特征的支气管哮喘是当前全球范围内危害人类健康的常见慢性病,发病率占普通人群的1%-18%(哮喘国际指南GINA2014)[1],据统计,世界范围内有超过三亿的哮喘患者,虽然近年来防治哮喘的工作不断深入,但是其发病率及死亡率仍呈上升趋势。且BHR不仅仅发生于哮喘患者,而且常常发生在一些呼吸系统疾患的患者,诸如伴随肺气肿、过敏性鼻炎、慢性支气管炎以及上、下呼吸道感染等疾患的患者。此类患者在围术期极易发生支气管痉挛、肺水肿等危急情况,已成为严重影响人们身心健康的公共卫生问题。有研究发现气道反应性疾病患者术中和术后支气管痉挛的发生与气管插管相关,术中支气管痉挛的发生率插管全麻(8.9%)要远高于不插管全麻(0%)。而随着社会的发展,全麻患者的比例越来越高,因此预防围术期气道高反应的的发生尤为重要,但目前对气道高反应的发生机制尚不十分清楚。中医药作为治疗气道高反应的常用措施,其疗效已获得中西医呼吸学专家的认可(2013版中国支气管哮喘防治指南将中医药列入支气管哮喘的临床治疗中)[7]。针刺作为中医药治疗气道高反应的重要手段,历代医家及近现代临床研究已证实其可以调节免疫功能,对气道高反应有良好的治疗作用,但是针刺治疗气道高反应的具体作用机制及作用靶点是什么?这仍然是制约传统针刺疗法发展的“瓶颈”之一。因此,本课题拟建立卵清蛋白(OV-albumin, OVA)致敏气道高反应BALB/c(BALB/cAnNCrl)小鼠模型,观察传统针刺疗法对OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠的作用,并以此为基础探讨针刺通过Notch信号介导调节气道高反应小鼠Foxp3/RoRγt失衡的机制,以期为针刺在围术期气道高反应中的应用提供理论和实验依据。第一节针刺对OVA致敏BALB/c小鼠气道高反应的影响目的：观察传统针刺疗法对OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠的作用。方法：一、气道高反应模型的建立及分组：SPF级BALB/c小鼠30只,6-8周,体重18-20g,随机分为正常对照组(NC组)10只,气道高反应模型组(BHR组)10只,针刺模型组(ACA组)10只。(一)、气道高反应模型组(BHR组)：参照文献的方法BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以无菌生理盐水溶解的卵蛋白50μg和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；且于第17～21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；(二)、正常对照组(NC组)：BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以生理盐水0.2ml致敏,且于第17～21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；(三)、针刺模型组(ACA组)：气道高反应模型制作同BHR组,且于第17天开始捆绑固定小鼠,针刺足三里(3mm)、大椎(3mmm),,平补平泄,隔天一次,每次20分钟,共3次。于第0、7、14天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50μ g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天。二、观察指标(一)、各组小鼠一般情况；(二)、全身体积描记仪记录乙酰甲胆碱(Methacholine, Mch)激发后Baseline Perth值；(三)、用显微镜观察肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中白细胞的分类和计数；(四)、用光学显微镜观察肺组织病理切片中气道与肺组织的形态结构。结果：一、正常对照组(NC组)BALB/c小鼠毛色光泽、体重增加、呼吸频率及幅度正常；气道高反应模型组(BHR组)毛色失去光泽、体重减轻、精神较差、呼吸频率增加、时伴有不同程度的呼吸困难；针刺模型组(ACA组)较BHR组症状减轻；二、与NC组比较,BHR组气道高反应性在不同浓度Mch激发下明显升高,当Mch浓度大于3.12mg/ml后,气道高反应性明显升高,且差异有显著性(P<0.01)；ACA组与BHR组比较,气道高反应性降低,且乙酰甲胆碱浓度为6.25mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml时,差异有显著性P<0.01)；三、BHR组BALB/c小鼠的BALF中嗜酸性粒细胞(Eosnophils, EOS)计数大于NC组,ACA组小于BHR组(P<0.01)；与NC组比较,BHR组、ACA组中性粒细胞(Neutrophil, NEU)较正常组明显升高,且差异有显著性(P<0.01)；与NC组比较BHR组、ACA组巨噬细胞(Macrophage, MOP)百分比降低,ACA组较BHR组降低幅度小,差异有显著性(P<0.05)；四、BALB/c小鼠肺组织病理HE染色结果显示NC组肺组织支气管粘膜上皮细胞排列整齐,无明显炎症,支气管内清洁无明显分泌物；BHR组支气管上皮细胞可见局灶性脱落,皱折增多,粘膜充血水肿,支气管管腔内及肺间质可见分泌物,EOS局灶性浸润；ACA组支气管粘膜上皮细胞排列整齐,粘膜轻度充血,管腔内见少许脱落上皮细胞。结论：祖国医学传统针刺疗法对OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠的临床症状、气道高反应性、肺组织病理性形态学有改善作用。第二节针刺对气道高反应小鼠T淋巴细胞分化、Foxp3/RORγt平衡的影响目的：一、观察针刺对气道高反应BALB/c小鼠T淋巴细胞分化的作用；二、 观察针刺对气道高反应BALB/c小鼠Foxp3/RoRγt平衡的影响。方法：一、气道高反应模型的建立及分组：SPF级BALB/c小鼠30只,6-8周,体重18-20g,随机分为正常对照组(NC组)10只,气道高反应模型组(BHR组)10只,针刺模型组(ACA组)10只。(一)、气道高反应模型组(BHR组)：参照文献的方法BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以无菌生理盐水溶解的卵蛋白50μg和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；且于第17-21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；(二)、正常对照组(NC组)：BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以生理盐水0.2ml致敏,且于第17-21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；(三)、针刺模型组(ACA组)：气道高反应模型制作同BHR组,且于第17天开始捆绑固定小鼠,针刺足三里(3mm)、大椎(3mmm),平补平泄,隔天一次,每次20分钟,共3次。于第0、7、14天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50μ g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天。二、观察指标(一)、通过流式细胞技术检测针刺介导OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠脾内CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞百分比；(二)、免疫组化检测针刺对气道高反应CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞特异性转录因子Foxp3、RORγt蛋白表达；(三)、RT-PCR检测肺组织中CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞特异性转录因子Foxp3mRNA、RORγt mRNA表达。结果：一、NC组相比,BHR组及ACA组BALB/c小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞的百分比明显下降(P<0.01), BHR组CD4+ CD25+调节性T细胞的百分比ACA组下降更为明显,且有统计学意义(P<0.01)。与NC组比较,BHR组及ACA组Th17细胞占CD4+T细胞的百分比较正常对照组显著升高(P<0.01),ACA组CD4+T细胞的百分比较BHR组下降,且有统计学意义(P<0.01)。二、免疫组化检测肺组织中RORyt、Foxp3蛋白表达结果：BHR组及ACA组BALB/c小鼠肺组织RORyt蛋白表达明显高于NC组(P<0.01), ACA组蛋白表达水平降低,但仍高于正常对照组(P<0.01); BHR组及ACA组BALB/c小鼠肺组织Foxp3蛋白表达明显低于NC组(P<0.01), ACA组蛋白表达水平降低,且与BHR组比较差异有显著性(P<0.01)。三、RT-PCR检测肺组织中RORyt、Foxp3mRNA表达结果：BHR组及ACA组BALB/c小鼠肺组织RORytmRNA含量明显高于NC组(P<0.01), ACA组RORytmRNA含量较BHR组水平降低,但仍高于NC组(P<0.01); BHR组及ACA组BALB/c小鼠肺组织Foxp3mRNAmRNA含量明显低于NC组(P<0.01), ACA组Foxp3mmRNA含量与BHR组比较降低,但无统计学意义结论：一、OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠Treg/Th17、Foxp3/RoRyt失衡,Treg/Th17、 Foxp3/RoRyt失衡变化一致,且都与气道高反应呈负相关;二、传统针刺疗法可影响OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠T淋巴细胞分化,调节Treg/Th17失衡；三、传统针刺疗法可调节OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠Foxp3/RoRyt失衡。第三节 针刺介导Notch对气道高反应BALB/c小鼠FOXP3/RORγt的作用目的：一、探讨Notch信号对气道高反应BALB/c小鼠Foxp3/RoRyt失衡中的影响；二、观察针刺介导Notch信号在气道高反应BALB/c小鼠Foxp3/RoRyt失衡中的作用。方法：一、气道高反应模型的建立及分组：SPF级BALB/c小鼠30只,6～8周,体重18～20g,随机分为正常对照组(NC组)10只,气道高反应模型组(BHR组)10只,针刺模型组(ACA组)10只。(一)、气道高反应模型组(BHR组)：参照文献的方法BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以无菌生理盐水溶解的卵蛋白50μ g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；且于第17～21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；(二)、正常对照组(NC组)：BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以生理盐水0.2ml致敏,且于第17-21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；(三)、针刺模型组(ACA组)：气道高反应模型制作同前,且于第17天开始捆绑固定小鼠,针刺足三里(3mm)、大椎(3mmm),平补平泄,隔天一次,每次20分钟,共3次。于第0、7、14天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50 u g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天。二、观察指标(一)、通过RT-PCR检测肺组织中Notch1 mRNA、Notch3mRNA、CSLmRNA的含量；(二)、Western blot检测肺组织中Notch1、Notch3、CSL蛋白表达的变化,探讨针刺对气道高反应小鼠Notch信号的影响。结果：一、RT-PCR检测肺组织中Notch1 mRNA、Notch3mRNA、CSLmRNA的含量结果：BHR组Notch1mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.01), ACA组Notch1 mRNA的表达较正常对照组升高(P<0.05)；BHR组、ACANotch3 mRNA的表达较NC组明显降低(P<0.01)；CSLmRNA的表达三组差异无统计学意义。二、Western blot检测肺组织中Notch1、Notch3、CSL蛋白表达结果：BHR组、ACA组Notch1蛋白的表达较正常对照组明显升高(P<0.01), ACA组Notch1蛋白的表达较BHR组降低,且差异有统计学意义(P<0.01); BHR组、ACA组Notch3蛋白的表达较NC组明显降低(P<0.01), ACA组组Notch3蛋白的表达较BHR组升高,差异有统计学意义(P<0.01); CSL蛋白的表达三组差异无统计学意义。结论：一、Notch信号介导了BALB/c小鼠气道高反应的发生；二、Notch1与BALB/c小鼠气道高反应呈正相关,与Foxp3/RoRyt比值呈负相关；Notch3与BALB/c小鼠气道高反应呈负相关,与Foxp3/RoRyt比值呈正相关。三、传统针刺疗法可影响OVA致敏气道高反应BALB/c小鼠Notch1、Notch3的表达。第四节针刺通过Notch信号介导调节Foxp3/RoR y t平衡的机制目的：探讨针刺通过Notch信号介导调节Foxp3/RoRyt平衡的机制。方法：一、气道高反应模型的建立及分组：SPF级BALB/c小鼠18只,6-8周,体重18-20g,随机分为正常对照组(NC组)6只,气道高反应模型组(BHR组)6只,针刺模型组(ACA组)6只。(一)、气道高反应模型组(BHR组)：参照文献的方法BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以无菌生理盐水溶解的卵蛋白50μ g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；且于第17-21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；(二)、正常对照组(NC组)：BALB/c小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射以生理盐水0.2ml致敏,且于第17～21天开始捆绑固定小鼠,隔天一次,每次20分钟；第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天；(三)、针刺模型组(ACA组)：气道高反应模型制作同BHR组,且于第17天开始捆绑固定小鼠,针刺足三里(3mm)、大椎(3mmm),平补平泄,隔天一次,每次20分钟,共3次。于第0、7、14天腹腔注射以PBS溶解的卵蛋白50 u g和氢氧化铝2mg混悬液0.2ml致敏,第21天予以1%卵蛋白滴鼻吸入激发,每日一次,连续3天。二、观察指标染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, CHIP)实验确定RORγt、Foxp3与Notch的结合量。结果：一、BHR组BALB/c小鼠肺组织RORytmRNA与Notch结合量明显高于NC组,ACA组肺组织RORytmRNA与Notch结合量水平降低,但仍高于NC组(P<0.01);BHR组BALB/c小鼠肺组织Foxp3mRNA与Notch结合量明显低于NC组(P<0.01), ACA组Foxp3mRNA与Notch结合量水平降低,且与高于BHR组有统计学差异(P<0.01)。二、Foxp3、RORγt与Notch的结合量的比值与肺组织中Foxp3/RORyt蛋白及基因的表达量的比值呈正相关。结论：针刺通过Notch信号调节气道高反应小鼠Foxp3/RoRyt平衡的作用可能是通过Notch信号与CD4+CD25+调节性T细胞和Th17细胞特异性转录因子Foxp3、RORγt蛋白直接结合实现的。第五节针刺对全麻诱导期患者血液动力学及肺顺应性的影响目的：观察针刺对全麻诱导期患者血液动力学及肺顺应性的影响。方法：选取40例ASA分级为Ⅰ-Ⅱ级、年龄18-65岁、拟在气管插管全身麻醉下实施择期脊柱外科手术的患者。随机分为两组,每组20例。分别为针刺组(A组)在术前30min予2/15Hz疏密波电针刺激病人双侧内关、曲池穴,刺激强度为电流0.5-1mA,时间为30分钟；对照组(C组)未予电针刺激单纯经静脉全麻诱导。观察患者一般情况,血液动力学指标及肺通气相关指标。结果：(一)一般资料比较两组患者的性别构成比、年龄、体重、身高差异均无统计学意义(P>0.05)。(二)、血流动力学指标两组诱导后的心率、血压和RPP值都较入室后基础值及诱导前明显下降(P<0.05),插管即刻、插管后1 min的心血管指标较诱导后明显增高(P<0.05)。两组插管后RPP的值均较诱导后值显著升高,但A组RPP增高持续的时间较C组短。且A组插管后10minRPP值较C组低(P<0.05)。(三)肺通气相关指标两组患者插管后插管即刻(T4)、气管插管后2min(T5)、 10min(T6)、20 min(T7)Pplat没有明显变化；T4、T5、T6 Ppeak没有明显变化,T7时间点A组Ppeak较C组及T4时间点明显降低(P<0.05); T4、T5、T6 Cdyn没有明显变化,T7时间点C组Cdyn较T4时间点明显降低(P<0.05); T4、T5 ETCO2没有明显变化,T6、T7时间点C组ETCO2较T4时间点明显降低(P<0.05)。结论：与对照组相比,应用针刺组血液动力学指标及肺通气相关指标均可得到明显改盖