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单克隆抗体目前被广泛应用于疾病的治疗与诊断,但由于抗体分子量较大,易引起治疗中免疫原性及诊断中假阳性等问题,而其片段Fab或F(ab’)2因分子量较小,故其具有穿透性更强,免疫原性更低,安全有效等优点,本文以β-HCG单克隆抗体为模型蛋白,研究单抗消化及其片段纯化方法,具有重要的研究意义和应用价值。本文首先采用了饱和硫酸铵沉淀法、正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、蛋白A亲和层析法分别从小鼠腹水中纯化β-HCG单克隆抗体。结果表明:饱和硫酸铵沉淀法纯化所得的抗体纯度为67.8%,抗体蛋白回收率为9.47%;正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化所得的抗体纯度为84.5%,抗体蛋白回收率为13.25%;蛋白A亲和层析法纯化后的HCG抗体纯度较高,为98.0%,抗体蛋白回收率为10.60%,其抗体回收量为3.76mg/mL腹水,综合考虑,选择蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水中的HCG单克隆抗体。其次,分别采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶消化抗体,结果显示木瓜蛋白酶消化效果较好,选用多种载体对木瓜蛋白酶进行固定化研究,结果表明温敏载体NHS-PNIPAM固定化效果较佳,并对固定化条件进行了优化,结果表明最佳条件为:在22℃,pH 8.5的硼酸缓冲溶液中,按给酶量0.6 mg/mg载体,60r/min,反应2h。制备得到的固定化酶活力达87.5 U/mg。其最适pH为7.5,最适温度为65℃,温敏循环30次后,相对剩余酶活为84.1%,于4℃储存60天,相对剩余酶活为74.1%,米氏常数为3.63 mg/mL。利用温敏载体NHS-PNIPAM固定化木瓜蛋白酶消化HCG单克隆抗体并对消化工艺进行优化。结果表明:在30℃,pH7.0的磷酸盐缓冲液中(含10mmol/L半胱氨酸,2mmol/L EDTA),给酶量40U/mg抗体,转速180r/min,反应3h,HCG抗体的转化率大于98.0%,主要生成目的产物Fab片段。最后,通过凝胶层析法、离子交换层析法、蛋白A亲和层析法、蛋白L亲和层析法分别对HCG抗体消化液中的Fab片段进行纯化,其中,凝胶层析法纯化所得的Fab片段纯度为85.3%,回收率为42.7%;DEAE-FF离子交换层析法纯化所得的Fab纯度为93.2%,回收率为51.6%;蛋白A亲和层析法纯化所得的Fab纯度为91.5%,回收率为63.1%;蛋白L亲和层析法纯化所得的Fab纯度达98.6%,回收率为74.5%,为最佳的Fab片段纯化方法。