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壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰化的产物,是一种氨基多糖。由于具有成本低、可生物降解、有生物相容性、无毒、生物亲和性好、易于化学改性等优点,壳聚糖被广泛应用于生化、医学等领域,是很有前景的生物高分子。磁性壳聚糖微球是一种新型的功能高分子材料,它是指内部含有磁性金属或金属氧化物(铁、钴、镍及其氧化物)的超细粉末而具有磁响应性的壳聚糖微球。磁性壳聚糖微球可作为固定化酶的载体,从而提高酶的操作稳定性和酶的反复利用程度。本论文研究了磁性壳聚糖微球的制备,以及分别用物理吸附和化学结合法制备固定化纤维素酶,考察了其酶学性能。主要研究内容和结果如下:
(1)磁性壳聚糖微球制备的条件
为了得到球形较好,粒径较为均匀以及磁响应性好的磁性壳聚糖微球,本论文通过实验研究了包括壳聚糖浓度、搅拌速度、表面活性剂用量、磁粉用量等因素对磁性壳聚糖微球的影响。经研究发现,在壳聚糖用量为0.7g,搅拌速度为400r/min,石蜡用量为50ml,正丁醇用量为4ml,Span-80用量为2ml,甲醛和戊二醛用量分别为2ml和1.5ml的条件下可以制备较好的磁性壳聚糖微球。
(2)物理吸附法制备磁敏性固定化纤维素酶
采用物理吸附法,在上述制备的磁性壳聚糖微球上固定化纤维素酶。研究了在不同条件下的纤维素酶固载量及其活性。研究发现,在吸附时间为30min,酶液浓度为2mg/ml,pH值为3时可以得到最大的固载量;在温度为70℃,pH值为6的条件下,固定化纤维素酶的酶活最高。
(3)化学结合法制备磁敏性固定化纤维素酶
在物理吸附法的基础上进一步研究了化学法制备固定化纤维素酶。采用了二元法,通过利用壳聚糖微球上的氨基和活化后的羟基来固定化纤维素酶,在研究了不同活化方法后,最终采用先用EDC活化羟基,后用戊二醛固定化的方法固定化纤维素酶。研究了不同因素对固定化酶以及酶活的影响,发现在反应时间为30min,反应温度为50℃时固载量最大;在酶解反应中,pH值为6,反应温度为70℃时固定化纤维素酶酶活最高。
(4)研究了磁场条件下磁敏性固定化纤维素酶及其游离酶的酶活特性
将自制的固定化酶和游离酶分别在磁场中进行反应,通过改变磁场强度和磁化时间,研究其酶活特性的改变。研究发现,游离酶和物理吸附法制固定化酶的“磁阈值”分别为500mT和700mT。游离酶、物理吸附法固定化酶和化学法固定化酶在曝磁时间为60min、90min和150min时活性达到最高。