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家畜的繁殖性能是畜牧业中衡量家畜生产性能的一个重要指标,家畜的繁殖力主要由下丘脑一垂体一性腺轴精确调控。抑制素是家畜下丘脑一垂体一性腺轴调控系统的一种重要的水溶性糖蛋白激素,主要由雄性动物的睾丸支持细胞和雌性动物的卵泡颗粒细胞分泌。应用抑制素进行主动或被动免疫家畜可以打破家畜生殖内分泌激素间的动态平衡,中和内源性类固醇激素或抑制素,解除其对FS}t分泌的负反馈抑制作用,调控家畜的繁殖活动。本研究应用RT—PCR技术扩增了蓝塘猪抑制素α亚基基因编码区全长,并将其成熟肽基因进行了克隆、表达,表达蛋白纯化后免疫家畜,通过观察家畜繁殖性能发生的改变及其产生的抑制素抗体滴度和体内相应激素水平的检测,进一步探索研究了抑制素重组融合蛋白免疫对家畜繁殖活动的调控作用。
本研究利用RT—PCR技术克隆了蓝塘猪抑制素α亚基基因编码区序列,全长1095bp,含完整的抑制素α亚基基因编码区序列,编码364个氨基酸残基。Blast分析显示与6enbank登陆号NM_214189的序列相比,共有8处核苷酸改变(G19lA,G269A,A359G,G417A,C457T,A465G,A501G,G510A),其中3处导致了氨基酸改变(G1y64Glu,Arg∞ms,ms120Arg),核苷酸序列的同源性达99.3%,氨基酸同源性为98.9%,而成熟肽部分的核苷酸序列完全相同。将蓝塘猪抑制素α亚基成熟肽的cDNA插入到T7启动子控制下的高效表达载体pRSETA的BglⅡ和EcoRⅠ两个位点之间,构建了猪抑制素α亚基成熟肽的重组表达质粒pR—IM。重组质粒pR一IM在£coJiBL21(DE3)中以包涵体的形式表达了175个氨基酸残基的抑制素α亚基重组融合蛋白,表达蛋白经0.05mMIPTG诱导5小时之后表达量达到最高,大约占总菌体蛋白的32%左右。并且表达产物可以经50%№一NTA凝胶纯化,利用兔抗牛α抑制素抗体对重组质粒pR~IM所表达的重组蛋白进行Westernblot分析,能被兔抗牛一抑制素抗体识别,表明成功获得了猪抑制素α亚基成熟肽融合蛋白。在此基础上,本研究大量表达猪抑制素α亚基成熟肽融合蛋白并制备了猪抑制素α亚基成熟肽融合蛋白油乳剂疫苗。
本研究应用主动免疫猪抑制素α亚基成熟肽重组融合蛋白疫苗主动免疫成年种公猪和后备母猪,观察成年种公猪精子活力和精子密度的变化以及后备母猪初情期的长短,检测体内相应的抗体水平和激素变化,进一步研究了主动免疫猪抑制素α亚基成熟肽重组融合蛋白对种猪生产性能的影响。对杜洛克2岁公猪主动免疫猪抑制素α亚基成熟肽重组融合蛋白疫苗后能产生高水平的抗抑制素抗体,在整个试验阶段,对照组没有产生抗抑制素抗体。在首免60天后到试验结束时的150天,免疫组公猪的精子密度显著上升,与对照组相比,差异显著(P
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