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洋葱(Allium cepa L.)属百合科葱属,是世界主栽蔬菜之一,也是我国主要的出口蔬菜之一。FT(FLOWERING LOCUS T)基因是开花植物光周期反应过程中调控植物成花的关键基因,也是重要的开花整合因子。实验室在前期工作中已经成功克隆了洋葱的开花素类似基因Ac FT1及Ac LFT,为确定其功能,本试验分别构建了Ac FT1及Ac LFT的正义、反义和RNAi干扰的植物表达载体,通过冻融法导入到根癌农杆菌EHA105中,进而通过花序侵染法转入模式植物拟南芥中。通过荧光定量PCR法测定Ac FT1及Ac LFT在拟南芥抽薹前叶片中的相对表达含量,观察转化植株的形态学指标,继而确定Ac FT1及Ac LFT在洋葱成花中的作用,为实现洋葱抽薹开花的基因调控提供参考。试验结果归纳如下:⑴构建了Ac FT1的正义植物表达载体p Z-Ac FT1,反义植物表达载体p R-AcFT1,RNAi植物表达载体p RNAi-Ac FT1;构建了AcLFT的正义植物表达载体p Z-AcLFT,反义植物表达载体p R-Ac LFT,RNAi植物表达载体p RNAi-Ac LFT.;⑵利用冻融法将重组质粒p Z-Ac FT1、p R-Ac FT1、p RNAi-Ac FT1、p Z-Ac LFT、p R-Ac LFT、p RNAi-Ac LFT导入根癌农杆菌EHA105中,利用花序侵染法对拟南芥进行转化。经过抗性筛选,转Ac FT1基因抗性苗56株;转Ac LFT基因抗性苗74株。提取抗性植株DNA,经PCR鉴定,获得转Ac FT1阳性株33株,转化效率为59%;转Ac LFT阳性株50株,其化率为68%。⑶用荧光定量PCR检测Ac FT1和Ac LFT在拟南芥中的相对表达含量,转正义的Ac FT1及Ac LFT基因在拟南芥植株内的相对表达含量都较高;转反义Ac FT1基因在拟南芥植株内的相对表达量降低;转Ac FT1基因的RNA干扰表达载体的基因的相对表达量几乎检测不到;而转Ac LFT基因的反义及RNAi载体的拟南芥植株的基因相对表达量与非转基因植株相比没有太大的变化。⑷对转基因植株进行表型分析,与野生型拟南芥相比,Ac FT1过量表达的转基因拟南芥植株花期大都提前:对照植株29.7天开花,转基因植株20.3天开花,提前了9天,但生长势较弱,转基因植株株高比对照降低27.4cm,莲座叶数目平均减少16片,叶片面积减少2.3cm2,此外,花的结构并没有变化,但荚果变小;AcFT1反义表达的转基因拟南芥植株花期大都延迟,平均延迟了9天左右,植株生长势较弱,也表现为叶片数目减少,株高降低。在花的结构上,部分花序没有形成花;转化Ac FT1干扰载体的转基因植株抽薹出的花序明显减少,只开少量的花,且花期延迟10天以上,植株生长势弱,莲座叶的数量减少14片,株高与野生型和其他转基因植株相比为最矮,比野生型拟南芥矮38.8cm。⑸转Ac LFT正义、反义及RNAi载体的拟南芥植株在开花时间上与野生型相比并没有太大的差异,但Ac LFT过表达的植株花序发生数增多,反义表达和RNA干涉的植株花序明显变少。此外,植株形态上也有所变化:转正义、反义、RNAi Ac LFT的植株株高比野生型植株分别矮27.7cm、35.1cm和37.2cm,莲座叶数目均比野生型植株少16、17、17片,叶面积平均减少2.3 cm2、2.6 cm2、2.6cm2。⑹转基因结果表明:洋葱Ac FT1基因为开花素基因,它的过量表达可以促进植物提前开花,缺乏则会导致植物的成花抑制。该基因也影响了花序分生组织的发生,它的过表达有利于花序发生,而它的表达缺失则会抑制花序的发生。洋葱Ac LFT虽然在结构与表达上类似于开花素基因,但它并不直接参与成花它的功能与花序发生相关。