近年研究发现,肝素酶（heparanase,HPSE）是一种能降低细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans,HSPG）的内切糖苷酶。它通过降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）,为肿瘤细胞的转移创造了条件。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指小分子双链RNA（small interfering RNA,siRNA）介导的转录后基因沉默现象。本实验希望通过RNAi技术在转录后水平阻断HPSE基因的表达,从而降低肿瘤细胞的浸润和转移,为临床预防肿瘤转移奠定了理论基础,并为肿瘤的治疗带来了希望。根据已发表的基因库中的人肝素酶基因序列,设计出与HPSE以外的基因组没有同源性的4条最佳序列（HPSE-1:5’GCA ATG AAC CTA ACA GTT TCC3’;HPSE-2:5’GCT TTA TGT GGC TGG ATA A3’;HPSE-3:5’CTG TCA GCC CGA ATG GGA A3’;HPSE-4:5’CTT GCC ACC TTT AAT GGA A3’）。取2μg质粒pGPU6/GFP/Neo载体,按照相应体系进行酶切处理,形成线性质粒载体。将设计的DNA寡核苷酸（oligo）分别用Tris-EDTA缓冲液溶解,取相应的正义链和反义链oligo溶液,在PCR仪上按照相应程序进行退火处理,形成shRNA模板。线性pGPU6/GFP/Neo载体与shRNA模板连接,构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo载体,碱裂解法抽提质粒,用BamH I,Pst I分别酶切鉴定重组质粒,并将阳性重组体送上海英骏生物技术有限公司测序。常规培养MDA-MB-231细胞。将构建好的重组质粒载体按照脂质体转染试剂盒LipofectaminTM2000操作说明转染MDA-MB-231细胞,实验设HPSE-1组;HPSE-2组;HPSE-3组;HPSE-4组;NEGATIVE CONTRAL组（阴性对照组）;MOCK组（只添加转染试剂组）;BLANK组（空白对照组）。转染细胞24 h和48 h后荧光显微镜观察细胞,pGPU6/GFP/Neo重组载体转染MDA-MB- 231后在绿色荧光激发波长下细胞应显示为绿色,转染后24 h和48 h荧光显微镜照片证明转染成功。Trizol法提取HPSE的总RNA。RT-PCR扩增条件为95oC（3 min）变性,95oC（30 s）,62oC（40 s）,共40个循环。Western blot检测HPSE蛋白的表达情况。实验结果显示:成功构建了带绿色荧光蛋白标记的重组质粒pGPU6/GFP/Neo载体;RT-PCR检测干扰组HPSE mRNA的表达明显降低;western blot显示干扰组HPSE蛋白的表达也明显降低,其中HPSE-1组mRNA的表达明显降低;MTT比色法检测细胞生长抑制率,24 h、48 h、72 h后重组质粒组细胞生长抑制率相对于对照组的细胞明显提高（P <0.05）。本实验将有利于阐明HPSE在乳腺癌及其他肿瘤侵袭转移中的作用机制,通过RNAi技术干扰HPSE在肿瘤转移中的关键酶作用,并降低HPSE蛋白的表达,从而抑制肿瘤的转移,为以后研制抗肿瘤的基因药物和方法提供理论依据和基础。