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玉米是重要的粮饲兼用作物,种子发育是决定产量和品质的重要因素。因此,研究玉米种子发育的遗传调控机制具有重要意义。近年来,一些玉米种子发育突变体被相继报道,通过对这些突变体的研究为我们进一步揭示玉米种子发育的遗传调控网络奠定了一定基础,但由于玉米种子发育是多基因协同调控的复杂过程,其遗传调控机制尚不清楚。筛选新的玉米种子发育突变体,克隆相关基因并进行系统的功能研究,将促进玉米种子发育关键基因的发掘和遗传调控网络的解析,为玉米产量和品质等相关性状的遗传改良提供基因资源和理论支持。我们利用EMS诱变筛选获得了多个种子发育突变体,其中突变体dek59-2的种子显著变小且存在一定程度的干瘪,胚和胚乳发育异常。遗传学分析表明dek559-2的种子发育缺陷表型是受单个核基因控制的隐性性状,利用分子标记定位,结合候选基因的测序比对和表达分析分离了目的基因Dek559-2,并对其进行了初步的功能研究,这些工作为后续解析Dek559-2突变引起玉米种子发育缺陷的分子机制奠定了坚实的基础。具体内容如下:1、突变体dek559-2的表型鉴定种子形态观察发现,突变体dek559-2的种子较WT显著变小,百粒重仅为WT的12%左右,种子萌发实验表明成熟的dek559-2的种子基本不能萌发。由于种子萌发受诸多因素影响,如种子成熟度等,为进一步明确Dek559-2突变对胚发育的影响,我们分别剥取了授粉24天的dek559-2和WT幼胚,发现dek559-2幼胚的确较WT显著变小。将剥取的幼胚置于1/2 MS培养基上进行发芽实验,发现dek559-2幼胚的萌发力较WT显著降低,仅为WT的35%左右。石蜡切片观察发现,突变体dek559-2的种子发育较WT明显滞后,淀粉粒的数量显著减少。成熟种子的电镜观察发现,突变体dek559-2胚乳中淀粉粒的数量也明显减少、出现许多孔洞且表面粗糙。因此,Dek559-2突变严重影响了玉米胚和胚乳的发育。2、突变体dek559-2的遗传学分析对W64/dek559-2 F2果穗中的正常籽粒和缺陷籽粒进行统计分析和卡方检验,结果发现其遗传分离比符合3:1孟德尔遗传分离第一定律,表明dek559-2的种子发育缺陷表型是由单个核基因控制的隐性性状。3、Dek559-2的图位克隆选取W64/dek559-2 F2分离果穗中的突变籽粒提取DNA,利用Indel标记将Dek559-2定位于3号染色体上的230 Kb的物理区间内。该区间内含有4个预测基因,分别命名为Gene1-4。qPCR分析发现该4个基因在dek559-2和WT间的表达丰度无显著差异。基因组DNA和cDNA序列的测序比对发现,Gene2-4的碱基序列在dek559-2和WT之间一致,而Gene1的第2个内含子的第2个碱基发生了 T到C的突变,结果导致该内含子不能被切除,并且蛋白翻译提前终止。目前正在对该基因进行进一步的转基因功能验证。4、Dek559-2的表达模式和亚细胞定位表达分析表明Dek559-2在玉米种皮、胚和胚乳中均表达。蛋白的亚细胞定位结果表明,其编码的蛋白定位于细胞质和细胞核中。5、Dek559-2突变打破了细胞的氧化还原平衡,影响了种子发育Dek559-2编码一个功能未知蛋白,隶属于Sufl superfamily,含有多个cupredoxin结构域,极有可能参与细胞的氧化还原调控,进而影响ROS水平。我们分别通过DAB和NBT染色对ROS的两个主要成分H2O2和O2-进行了检测,结果发现突变体dek559-2种子中的H2O2和O2-含量明显升高。进一步利用过氧化氢检测试剂盒对H2O2进行定量分析发现,突变体dek559-2种子中的H2O2浓度可达到WT的2.7倍左右。O2-含量的增加通常伴随着NAD(P)H脱氢酶活性的增加,利用NADPH氧化酶试剂盒检测发现突变体dek559-2种子中的NAD(P)H脱氢酶活性较WT上调了 4倍左右。上述结果表明Dek559-2突变的确导致了dek559-2种子中的ROS含量大幅度升高。ROS的大幅升高会导致细胞受损,甚至诱发PCD的发生。结合突变体表型鉴定结果,我们推测ROS爆发诱发的PCD加剧可能是造成dek559-2种子发育缺陷的一个重要原因,目前正在通过TUNNEL试剂盒检测确认。