研究背景和目的肾母细胞瘤(Wilms’ tumor,WT)是儿科最为常见的原发于肾脏的泌尿生殖系统恶性肿瘤,据统计,WT占所有儿科肿瘤的6%,其在小于15岁的儿童及青少年中综合发病率约为0.1‰。WT平均诊断年龄为36个月,大于10岁或小于6月龄的病例较为少见。肾母细胞瘤的发病原因尚未完全了解,目前认为,其可能起源于异常增生的、未正常分化形成肾单位的后肾胚基。肾母细胞瘤的组织学分类包括上皮型、胚芽型、间叶型及混合型四类;每一类又可根据是否含有间变细胞而分为预后好的组织结构(不含间变细胞,FH)及预后差的组织结构(可检出间变细胞,UH)。肾母细胞瘤的临床表现缺乏特异性,主要包括:无症状腹部肿块、血尿、腹痛、高血压,及肿瘤压迫症状等,并可伴发多种先天畸形,如WAGR综合征、BWS综合征、DDS综合征等。肿瘤的发生涉及多个基因的表达异常,是多因素、多阶段及体内外多种因素共同作用的复杂过程,并可能与遗传因素有关。而恶性肿瘤发生和演进过程中的一个重要特征,就是癌基因的激活或过表达与抑癌基因的缺失或表达抑制。同时,肾母细胞瘤是公认的应用现代综合疗法效果最好的小儿恶性实体肿瘤之一,目前肾母细胞瘤的治疗趋势是,在尽量保持并不断提高现有生存率的基础上尽可能减少治疗强度,以降低治疗相关并发症的发生率,最终降低病死率。因此,明确的诊断和分期,确切的病理分型,个体化的综合治疗,寻找敏感的分子生物学指标以指导治疗和随访,是改善肾母细胞瘤患儿预后,提高生存率的重要手段。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类仅含18-25nt的,具有基因表达调节功能的非编码,单链短序列RNA。研究发现,miRNA的作用几乎贯穿整个生命活动的全过程,其对细胞增殖、分化、细胞周期调控和细胞凋亡等方面的作用正日益受到关注。众多国内外研究成果都证实,miRNA复杂调节网络的紊乱与细胞增殖和凋亡过程的调节失控可能存在一定关联,因此miRNA可作为癌基因或抑癌基因,参与调控多种恶性肿瘤的发生和演进等关键阶段。作为miRNA中具有代表性的癌基因之一,miR-21在几乎所有研究过的实体肿瘤组织中均呈高表达,miR-21主要通过与多种抑癌基因mRNA的3’-UTR区不完全互补配对结合,使其功能受到抑制,从而发挥癌基因的作用。目前多种成人肿瘤的研究已经证实,miR-21的下游靶基因包括Maspin、PDCD4、PTEN、RECK、Sprouty(包括 Spry-1、Spry-2)、TIMP-3、TPM1 等,miR-21 通过调控上述抑癌基因,对多种肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移等恶性行为发挥重要的促进作用。但其在肾母细胞瘤中的表达及作用机理尚无文献报道。对于"明星"抑癌基因PTEN来说,其独特的磷酸酶活性可通过多种途径在细胞的生命活动中发挥负调节作用,拮抗癌基因的作用,维持机体的正常代谢和内环境稳态。国内外大量研究表明,在包括肾母细胞瘤在内的多种进展期肿瘤中均可见PTEN的高频突变或缺失,提示其低表达与肿瘤的发生、演进及恶性行为关系密切。对于经典的具有癌基因活性的PI3K/AKT信号通路而言,其在多种研经究证实的肿瘤细胞中异常激活,对促进肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭、抑制凋亡,以及介导肿瘤细胞的化学耐药和放疗抵抗等机制中起着重要作用。而PTEN正是负向调控这一信号通路起始的关键酶之一,它可以通过一系列磷酸化作用显著抑制AKT的活化,进一步阻断AKT调控的下游信号转导通路,对抗AKT作为癌基因的作用。在多种成人肿瘤的研究中,都提示或证实PTEN是miR-21潜在靶基因之一。因此我们推测,在肾母细胞瘤中,miR-21与PTEN也存在这种靶向调控关系,并通过这一靶向调控关系,进一步调控肾母细胞瘤的生物学行为。基于以上理论,本研究的目的是:分析miR-21及PTEN蛋白在小儿肾母细胞瘤组织和瘤旁正常对照组织中的表达差异,探讨miR-21和PTEN蛋白的表达与小儿肾母细胞瘤包括性别、年龄、临床分期、病理组织学类型及淋巴结转移等在内的多种临床病理参数及WT患儿预后的关系,并在此基础上,通过培养肾母细胞瘤原代细胞,采用miR-21 inhibitor抑制miR-21的表达,观察PTEN及下游PI3k/AKT信号通路蛋白表达,研究PTEN活性的变化,并研究miR-21表达抑制对肾母细胞瘤细胞包括细胞增殖、细胞侵袭及细胞凋亡等在内的生物学行为的影响,最终证实WT中两者的靶向调控关系,深入探究miR-21与PTEN参与WT发生演进的可能机制,以期为WT早期的分子生物学诊断及靶向治疗的研究提供一定的理论支持和实验参考依据。方法1.miR-21及PTEN在肾母细胞瘤组织中的表达、临床意义及与预后的相关性研究:收集89例小儿肾母细胞瘤患者肿瘤组织及30例瘤旁正常肾组织,采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹法分别检测miR-21及PTEN基因和蛋白的表达水平在WT和瘤旁组织中的差异,探讨miR-21和PTEN蛋白的表达与小儿肾母细胞瘤包括性别、年龄、临床分期、病理组织学类型及淋巴结转移等在内的多种临床病理参数及WT患儿预后的关系。两组之间基因和蛋白表达的差异采用两独立样本t检验,蛋白表达水平与肾母细胞瘤临床病理参数的关系统计采用χ2检验;生存分析方面,应用Kaplan-Meier法绘制并分析生存曲线,生存率的结果应用log-rank进行显著性检验,并进行预后的单因素回归分析;应用COX比例风险模型进行预后的多因素回归分析以探究影响WT患儿预后的独立危险因素,设P=0.05为检验水准。2.miR-21在肾母细胞瘤原代培养细胞中靶向调控PTEN机制的研究:采用细胞瞬时转染的方法将miR-21 inhibitor转染经实验证实的miR-21高表达的肾母细胞瘤原代培养细胞,抑制原代细胞中miR-21的表达,利用qRT-PCR、蛋白质免疫印迹法分别检测原代细胞中miR-21、PTEN mRNA和蛋白水平的变化,并观察其对PTEN/PI3K/AKT信号通路中关键蛋白表达的影响。随后利用CCK-8、Transwell小室和流式细胞技术观察抑制miR-21对WT原代细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。最后,利用双萤光素酶报告基因实验检测PTEN-3’-UTR活性变化。各基因及相关蛋白表达以均数±标准差形式表示,两个样本均数比较采用两独立样本t检验,多个样本均数比较采用ANOVA方差分析,以P= 0.05为检验水准。结果1.肾母细胞瘤组织中miR-21、PTEN的表达、临床意义及与预后的相关性:与瘤旁对照组织相比,肾母细胞瘤组织中,(1)miR-21的表达显著上调,而PTEN蛋白的表达显著降低,二者表达的差异有统计学意义;(2)miR-21表达上调与患儿年龄(>2y)、较高临床分期、病理组织分型(UH型)及有淋巴结转移等临床病理因素密切相关(P<0.05);PTEN蛋白的下调与患儿年龄(>2y)、较高临床分期、病理组织分型(UH型)等临床病理因素密切相关(P<0.05);(3)直线相关分析表明,miR-21与PTEN蛋白的表达存在负相关性(r =-0.687,P<0.05);(4)病例资料的2y及5y生存情况的单因素生存分析结果显示,miR-21高表达和PTEN蛋白的低表达与WT患儿的不良预后密切相关。多因素方差分析表明,尽管miR-21和PTEN蛋白相对表达量直接与多个临床病理参数及患儿预后相关,但尚不能成为影响WT患儿预后的独立危险因素。2.miR-21在肾母细胞瘤原代培养细胞中靶向调控PTEN机制:在WT原代培养细胞中,(1)转染miR-21 inhibitor可明显抑制miR-21的表达;(2)miR-21抑制后,PTEN蛋白水平增加,而mRNA表达水平变化不明显,证明miR-21在转录后水平沉默PTEN表达;(3)miR-21抑制后,PTEN蛋白表达水平增加,其下游的PI3K、p-AKT等信号通路关键分子的蛋白表达水平均降低,证实miR-21通过抑制PTEN,从而正向调节PI3K/AKT信号通路而发挥基因调节作用;(4)与阴性对照组(NC)和空白对照组(MOCK)比较,转染抑制组(IN)下调miR-21对明显抑制WT原代细胞的增殖和侵袭(P<0.05),显著增加WT原代培养细胞的凋亡(P<0.05);(5)双萤光素酶报告基因实验证实,IN组能导致野生型PTEN-3’-UTR萤光活性的增加,而NC组不能导致野生型PTEN-3’-UTR萤光活性的增加(P=0.002),证实PTEN在3’-UTR端受miR-21的直接调控;IN组中,野生型PTEN-3’-UTR萤光活性与突变型PTEN-3’-UTR相比显著降低(P=0.002),证实miR-21靶向调控PTEN的靶点位于突变位点;IN组和NC组对突变型PTEN-3’-UTR的萤光活性均无影响(P=1.000),证实PTEN分子3’-UTR端的突变位点作为miR-21的靶位点具有唯一性。结论1.WT组织中,miR-21表达上调,PTEN蛋白表达下调,两分子的表达水平呈负相关,并与肾母细胞瘤的恶性程度、侵袭性及不良预后关系密切,因此miR-21与PTEN分子可作为评价WT恶性程度、预后及辅助制定放化疗方案的有价值的分子标志物;2.WT原代培养细胞中,miR-21在转录后水平靶向负调控PTEN的表达,并通过PTEN正向调节PI3K/AKT信号通路而发挥其癌基因的调控作用。抑制miR-21的表达可显著影响包括抑制WT细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡在内的WT细胞的生物学行为,miR-21可能是WT治疗的一个潜在靶点,这为WT的靶向药物治疗提供了 一定的理论支持和实验参考依据。