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开花是植物生命活动过程中一个重要而复杂的过程,植物能感应环境因子的改变,并结合自身遗传因子做出相应的发育调控,以便在合适的环境条件下做出花的发育,从而最大可能的获取生存和繁殖后代的机会。这就使植物利用环境及遗传因子调控植物营养生长到生殖生长(即开花)的转变显得尤为重要,晚开花可能让植物生长得更加强壮,但不利于种子的产生;相对的,早开花不能保证植物有足够的能量储备来繁衍后代,由此可知开花时间的早晚关系到植物种子的形成,从而影响到植物种族的延续。影响植物开花的因素很多,包含环境因子和遗传因子,植物能通过多种遗传途径来对外界环境和植物内环境做出相应的反应,这些遗传途径复杂而精确地调控植物开花。遗传途径中涉及到多种调控花发育的基因整合子,包括促进开花的基因LEAFY、FT、SOC1、CO以及开花抑制基因FLC、SVP、FLM等。这些基因编码的蛋白大都属于于MADS-Like蛋白,如SCO1、AGL24、SVP等,它们能直接或间接的调控开花。有关SOC1、AGL24、SVP等蛋白的作用机制目前被广泛研究,其调控机制以及蛋白间的相互作用已经比较清楚。芥菜(Brassica juncea Coss)中开花整子SOC1、AGL24、SVP、FLC等的研究也有相应报道,但是有关芥菜AGL6、AGL15与SOC1、AGL24、SVP之间的互作关系未见报道。为探究芥菜AGL6、AGL15在芥菜开花网络中的调控关系,我们以芥菜QJ为材料,克隆芥菜AGL6、AGL15基因,并用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术研究芥菜AGL6、AGL15蛋白与其他开花整合子蛋白间的关系;在此基础上进一步使用酵母单杂交和双萤光素酶技术研究了AGL15启动子与其他蛋白之间的作用关系。主要试验结果如下:1.芥菜AGL6、AGL15的克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖总RNA反转录c DNA第一链为模板,分别扩增得到芥菜AGL6基因和AGL15基因的c DNA序列:AGL6的c DNA序列为759bp,编码252个氨基酸;AGL15的c DNA序列为795bp,编码264个氨基酸。以芥菜基因组DNA为模板扩增得到AGL6和AGL15的NDA序列为分别为1771bp和1616bp,c DNA和DNA对比发现,AGL15和AGL6都含8个外显子和7个内含子。二者均属MIKC型蛋白,预测表明AGL6和AGL15蛋白大小为分别为28.85k Da和30.13k Da,理论等电点分别为9.15和9.02,两者都属于不稳定蛋白,均与欧洲油菜亲缘关系最近。二级结构预测表明AGL6和AGL15分别含有α螺旋约40%与47%,主要集中在K域。2.芥菜AGL15启动子克隆与分析使用芥菜基因组DNA为模板,利用染色体步移法克隆得到AGL15的启动子890bp,分析表明AGL15启动子与油菜亲缘关系最近。对其进行生物信息学分析发现该序列中含有TATA-box、CGTCA-motif、TGGTTT-ARE等多种启动子相应元件。3.芥菜AGL6与SOC1、AGL24、SVP蛋白互作鉴定将克隆得到的AGL6基因构建到酵母双杂交质粒p GADT7(以下简称AD)和p GBKT7(以下简称BK)上得到AD重组质粒p GADT7-AGL6和BK重组质粒p GBKT7-AGL6,醋酸锂(Li AC)转化法分别转化酵母细胞Y187、Y2HGold得到Y187[p GADT7-AGL6]和Y2HGold[p GBKT7-AGL6]酵母转化子,使用对应的缺陷培养基检测确定酵母转化子无毒无自激活。将含有BK重组质粒([p GBKT7-AGL6)的Y2HGold酵母转化子细胞分别与含有AD重组质粒(p GADT7-SOC1、p GADT7-AGL24、p GADT7-SVP)的Y187酵母转化子细胞进行融合,同时设立相应的对照。结果显示,除阴性对照以外的阳性对照及AGL6与SOC1、AGL24、SVP三个蛋白的酵母融合细胞均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/Ab A(以下简称QDO/X/A)固体培养基上长出蓝色酵母菌落。将AGL6分别与与Bi FC载体中的N、C两端载体p GPTVⅡ.YFPN、p GPTVⅡ.YFPC相连接,构建p GPTVⅡ.YFPN-AGL6和p GPTVⅡ.YFPC-AGL6载体,通过冷热刺激法转入农杆菌GV3101。混合并注射4-6片本氏烟草叶片,48小时后置于荧光显微镜下观察,发现共注射组合GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SOC1]、GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-AGL24]、GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SVP]均发出黄色荧光,说明芥菜AGL6蛋白能分别SOC1、AGL24、SVP发生相互作用。4.芥菜AGL6氨基酸敲除突变体与SOC1、AGL24、SVP蛋白作用检测预测芥菜AGL6蛋白互作位点,分别构建三个氨基酸敲除突变体,AGL6D-NN(敲除第79和第80位的两个天冬酰胺氨(NN))、AGL6D-RT(敲除第105位的精氨酸(R)和第106位苏氨酸(T))、AGL6D-NNRT(同时敲除前面四提到的个氨基酸)。并构建酵母BK的氨基酸敲除突变体重组质粒p GBKT7-AGL6D-NN、p GBKT7-AGL6D-RT、p GBKT7-AGL6D-NNRT。将这三个含有突变体的Y2HGold酵母细胞分别与含SOC1、AGL24、SVP的Y187细胞进行融合,共9个组合,并设对照。结果表明,9个试验组合中,只有Y2HGold[p GBKT7-AGL6D-NNRT]×Y187[p GADT7-SVP]这1个组合的酵母融合二倍体不能在培养基QDO/X/A上产出菌落,其余8个试验组合及所有的阳性对照均能够在QDO/X/A产生蓝色酵母菌落,阴性对照则都不能。说明氨基酸敲除突变体AGL6D-NNRT不能与SVP蛋白发生相互作用,AGL6D-NN、AGL6D-RT能与SVP发生相互作用,而AGL6D-NN、AGL6DRT、AGL6D-NNRT均能与SOC1和AGL24发生相互作用。构建AGL6突变体N端突变体质粒p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN、p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-RT、p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT。分别将含AGL6突变体的农杆菌与GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SVP]农杆菌混合注射浸润烟草叶片,48小时后观察发现GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SVP]和GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-RT]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SVP]组合有黄色荧光发出。组合GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-SVP]无荧光发出,结果说明AGL6氨基酸敲除突变体AGL6D-NN、AGL6D-RT与蛋白SVP有相互作用,而AGL6氨基酸敲除突变体AGL6D-NNRT与SVP蛋白无相互作用。说明可能第79、80、105和106位上的氨基酸共同调控AGL6与SVP的相互作用。5.芥菜AGL15与SOC1、AGL24、SVP、AGL6蛋白互作鉴定将AGL15构建到分别构建到AD和BK质粒上得到酵母重组质粒p GADT7-AGL15和p GBKT7-AGL15。将含有AGL15的Y2HGold酵母细胞分别与待鉴定的含有SOC1、AGL24、SVP及AGL6的Y187酵母细胞进行融合,总共四个试验组合,平行设立对照试验。试验表明,含有AGL15的Y2HGold酵母与含有AGL24的Y187酵母组合Y2HGold[p GBKT7-AGL15]×Y187[p GADT7-AGL24]的二倍体酵母细胞能够在QDO/X/A平板上长出蓝色酵母菌,剩下的三个试验组合均不能生长,对照组试验结果同上。构建AGL15到Bi FC表达载体质粒共浸润本氏烟草叶片表皮细胞,48小时后置于荧光显微镜下观察。结果显示只有共浸润组合为GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL15]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPC-AGL24]的叶表皮细胞观察到了黄色荧光,其余组合无黄色荧光。说明芥菜中AGL15蛋白能与AGL24发生互作,但不能与SOC1、SVP发生互作。6.芥菜AGL15氨基酸敲除突变体与AGL24互作检测在线预测AGL15的蛋白作用位点,构建三个敲除氨基酸的突变体,分别为:AGL15D-EK(敲除第107(E)位谷氨酸和第10位赖氨酸(K))、AGL15D-R(敲除第170位精氨酸(R))、AGL15D-EKR(同时敲除以上三个氨基酸)。构建三个AGL15氨基酸敲除突变体的BK酵母表达质粒p GBKT7-AGL15D-EK、p GBKT7-AGL15 D-R、p GBKT7-AGL15 D-EKR。然后分别用含有AGL24的酵母细胞Y187分别与三个突变体转化子Y2HGold进行酵母的融合,同时设立对照,结果表明,阴性对照和阳性对照结果同上,试验组合中Y2HGold[p GBKT7-AGL15D-EK]×Y187[p GADT7-AGL24]酵母二倍体细胞能在QDO/X/A生长并呈现蓝色,而二倍体酵母Y2HGold[p GBKT7-AGL15D-R]×Y187[p GADT7-AGL24]及Y2HGold[p GBKT7-AGL15DEKR]×Y187[p GADT7-AGL24]在培养基QDO/X/A上无酵母长出。同时构建对应的Bi FC表达载体混合注射烟草表皮细胞,荧光显微镜下观察发现只有共侵染GV3101[p GPTVⅡ.YFPN-AGL15-A D-EK]×GV3101[p GPTVⅡ.YFPCAGL24]的有黄色荧光产生,其余两组均无荧光产生。由此可知芥菜AGL15氨基酸敲除突变体AGL15 D-EK能和AGL24蛋白发生相互作用,但是突变体AGL15 D-R和AGL15D-EKR均不能与蛋白AGL24发生相互作用,说明第170位氨基酸时调控AGL15与SVP蛋白相互作用的关键氨基酸位点。7.芥菜AGL15启动子与蛋白SOC1、AGL24、AGL15、AGL6的互作鉴定构建芥菜AGL15启动子酵母单杂重组质粒p Ab Ai-AGL15Q,将其转化到Y1HGold酵母得到Y1HGold(p Ab Ai-AGL15Q)酵母转化子,并进行抗Ab A浓度筛选。同时将构建好AD酵母重组质粒p GADT7-SOC1、p GADT7-AGL24、p GADT7-AGL15、p GADT7-AGL6质粒分别转化(Li AC)到含有AGL15启动子的酵母Y1HGold[p Ab Ai-AGL15Q]中得到Y1HGold[p Ab Ai-AGL15Q]+SOC1、Y1HGold[p Ab Ai-AGL15Q]+AGL24、Y1HGold[p Ab Ai-AGL15Q]+AGL15都能在Ab A浓度板上生长,但是Y1HGold[p Ab Ai-AGL15Q]+AGL6不能在Ab A+150浓度板上生长。同时将AGL15启动子构建到到双荧光素酶法载体p GreenⅡ0800-LUC上得到p GreenⅡ0800-LUC-AGL15Q。分别将启动子载体与其他四蛋白载体转化到农杆菌GV3101中得到GV3101[p GreenⅡ0800-LUC-AGL15Q]、GV3101[p GreenⅡ62-SKSOC1]、GV3101[p GreenⅡ62-SK-AGL24]、GV3101[p GreenⅡ62-SK-AGL15]、GV3101[p GreenⅡ62-SK-AGL6]。将GV3101[p GreenⅡ0800-LUC-AGL15Q]农杆菌分别与其他四个蛋白载体的农杆菌进行混合并注射浸入本氏烟草叶片,48小时后取材置于酶标仪下测定数值并计算。结果显示,AGL15启动子与SOC1、AGL24、AGL15的数值显著高于对照,但是与AGL6蛋白的数值不显著。说明AGL15启动子可以和SOC1、AGL24以及本身AGL15产生DNA和蛋白的相互作用