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目的将芽孢毒素中能裂解胞吐偶联蛋白的轻链及负责毒素转位入胞的重链N端和弹性蛋白酶特异性抑制因子Elafin的三者编码基因重组,得到工程酵母表达产物,观察该重组融合蛋白对黏液高分泌的生成及分泌过程的抑制效应,分析其可能作用的信号通路及转录因子靶点,其纯化的表达产物在气道局部治疗中将有广阔的临床应用前景。方法(1)构建pMD18-T-BoNT-LH(N)及pEGFP-N1-Elafin重组载体;用platnium pfx polymerase高保真酶通过PCR将从上述构建的重组质粒扩增出的BoNT-LH(N)片段和Elafin片段拼接成完整的BoNT-LH(N)-Elafin基因片段,并插入pPIC9K表达载体,构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组表达载体;( 2 )重组质粒pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin电转化入毕赤酵母GS115菌株,利用离子交换层析法分离纯化重组融合蛋白;检测重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin的免疫原性,抗中性粒细胞弹性蛋白酶活性及对呼吸道SNARE蛋白复合体的裂解作用;(3)培养气道上皮细胞,选择香烟烟雾抽提物(CSE)及脂多糖(LPS)作为刺激因素,采用RT-PCR、免疫细胞荧光法及ELISA法分别检测各组细胞MUC5AC的mRNA、胞内蛋白及胞外分泌蛋白的表达情况;采用Western blot检测各组p-JNK,p-ERK及p-P38蛋白含量及SNARE复合物(SNAP23,syntaxin 2及VAMP-2)裂解情况;采用荧光素酶报告基因检测系统测定各组激活蛋白-1(AP-1)及核转录因子-κB(NF-κB)的活性。结果( 1 )经酶切及DNA测序鉴定分析,成功构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组表达载体;(2)BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中大量表达,离子交换层析法分离纯化得到高浓度的纯化重组融合蛋白,分离纯化的重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin具有免疫具有良好的免疫原性,并同时具备Elafin的抗中性粒细胞弹性蛋白酶活性以及BoNT对呼吸道SNARE蛋白复合体如SNAP23,syntaxin 2以及VAMP-2不同程度的裂解作用;(3)CSE及LPS可上调MUC5AC的mRNA水平,增加MUC5AC胞内蛋白和分泌至胞外的蛋白的含量,重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可降低CSE及LPS上调的上述指标的水平;重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可抑制CSE及LPS诱导的JNK及ERK的磷酸化,降低CSE及LPS增强的AP-1及NF-κB的活性,并裂解CSE及LPS增加的SNARE复合物(SNAP23,syntaxin 2以及VAMP-2)。结论(1)CSE及LPS可增加MUC5AC的合成及分泌;重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可抑制CSE及LPS的上述效应;(2)重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可降低AP-1及NF-κB的活性从而下调黏蛋白的高表达及生成,此系通过降低JNK和ERK磷酸化水平及抑制IκBα蛋白的降解来实现的;重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可裂解黏蛋白胞吐过程中起重要作用的SNARE复合物从而降低黏蛋白的分泌;(3)重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin可从黏蛋白病理生成及分泌两方面起一定阻断作用抑制气道黏液高分泌,其纯化的表达产物在气道局部治疗中将有广阔的临床应用前景。