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造礁石珊瑚白化死亡现象日益频繁,严重时造成珊瑚礁退化。温度、光、环境化学毒物和细菌性疾病是导致造礁石珊瑚大量白化的重要原因,造礁石珊瑚白化机制假想模型认为造礁石珊瑚关键功能基因参与并影响造礁石珊瑚白化过程。通过基因芯片等分子生物学研究手段研究表明关键功能基因的表达和调控状况与珊瑚白化死亡或恢复有密切关系。同时利用目前的分子生物学技术来研究环境微生物对整个珊瑚共生体的健康或致病机理都有重要意义。目前,我国对珊瑚白化的重视程度不够,迫切需要加强对该领域的研究,为造礁石珊瑚白化机制研究提供基础理论。
本实验采用Trizol法提取了鹿角杯形珊瑚(Pocilolporadamicornis)、丛生盔形珊瑚(Galaxeafascicularis)、澄黄滨珊瑚(Poriteslutea)和霜鹿角珊瑚(AcroporaPruinosa)的总RNA,经琼脂糖凝胶电泳检测,所提取的总RNA的28S、18S条带清晰明亮,无降解,表明提取的总RNA质量较好。再通过反转录聚合酶链式反应(RT-RCR)得到cDNA,并以cDNA为模板设计引物进行test-PCR,获得澄黄滨珊瑚大小为254bp的ferritin基因cDNA序列。分析表明该部分序列编码了84个氨基酸,其中包含一个亚铁氧化酶活性功能区,而该活性功能区又有一个铁离子通道,其与多孔鹿角珊瑚(Acroporamillepora)的ferritin基因相似度最高,达85%,覆盖度为100%。推测该基因序列在种内和种间都较保守,已向GenBank提交序列,并获得登陆序列号为JQ305796,该序列可用于实时定量PCR技术(qRT-PCR)及cDNA末端快速扩增技术(RACE)等后续研究。进一步筛选到多对珊瑚18SrRNA及28SrRNA内参基因引物,同时利用半巢式RT-PCR技术检测并获得霜鹿角珊瑚的β-actin基因序列230bp,获得登陆序列号为JQ305793,为霜鹿角珊瑚功能基因表达分析中,β-actin作为内参基因的可行性提供了依据。讨论了内参基因的选择和珊瑚的RNA提取问题。
同时在水族缸中的霜鹿角珊瑚AP中检测到一株噬菌体,获得该噬菌体hypothetical基因部分cDNA序列(393bp),向GenBank提交序列,并获得登陆序列号为JQ305794。通过序列比对确定其与单胞杆菌属(Pseudomonassp.)噬菌体亲缘关系较为接近(73%),可能是一株新的株新的噬菌体。结合16SrRNA序列分析结果发现,水族缸水体及霜鹿角珊瑚中单胞杆菌属细菌种类丰富可能是该种噬菌体存在的原因,该噬菌体应该是寄生在假单胞杆菌属体内,能控制霜鹿角珊瑚共附生假单胞杆菌属细菌的数量。噬菌体与细菌之间的相互作用复杂多样,并在调节珊瑚内共生微生物群落、促进微生物进化、以及基因交流中扮演着重要的生态角色,但目前对它们之间的作用过程与机制还缺乏深入的了解。
最后,在水族缸中的霜鹿角珊瑚AP中还检测到两株细菌:Propionibacteriumacnes,Ochrobactrumanthropi。获得P.acnes的细胞分化基因1部分序列(390bp),其相似性达98%;O.anthropi的细胞外周质binding蛋白基因(287bp)和谷氨酸合成蛋白基因(234bp),其相似性分别为99%和98%。结合16SrRNA序列分析结果发现水族缸中霜鹿角珊瑚共附生细菌中确实含有这两种细菌。向GenBank提交序列,并获得登陆序列号分别为:JQ347373和JQ316680。