草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。其饲养成本低，养殖范围广，但养殖过程病害较多，其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%，给养殖生产带来了巨大的损失。引起草鱼病毒性出血病的病毒为草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV），隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV）。根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108株全序列，本研究对其编码VP5蛋白的M5基因序列进行了分析，同时构建其原核表达载体，制备重组VP5蛋白，检测了其NTPase(核苷三磷酸酶，nucleoside triphosphatases)活性，并对其免疫原性进行了初步研究。1.草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析GCRV-GD108的M5基因全长2230bp，含一个开放阅读框(ORF)2178bp。Blast结果显示M5基因编码分子量大小约80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明，该蛋白与水生呼肠孤病毒属中多个病毒株的核衣壳蛋白VP5的氨基酸同源性为24%-25%；与哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalian reovirus，MRV）的μ2及禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV）的MμA也有较高的同源性（20%）。且该蛋白包含一段μ2样NTP结合保守区域，因此可确定GCRV-GD108株M5基因编码的蛋白为VP5，与MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。2. GCRV-GD108株M5基因原核表达载体的构建及表达以根据已获得的M5基因cDNA序列，分别设计合成带特定酶切位点的特异引物，进行PCR扩增；通过酶切与连接，构建了两种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5，分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达；对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化，确定最适表达体系。SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。结果显示所构建的两种VP5蛋白原核表达载体，均在大肠杆菌中成功地表达了分子量大小与预期相符（约为80ku）的重组蛋白，且表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎，离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性，获得纯化的重组蛋白，其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%，纯化后获得了高纯度的重组蛋白（>95%）。比较两种表达载体的表达结果，认为表达载体pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。3.重组GCRV-GD108株VP5蛋白NTPase活性及免疫原性分析重组蛋白经纯化后，进行ATPase活性测定，通过钼酸铵比色法分析显示重组VP5蛋白具有一定的ATPase活性，活力为0.693μmolPi/mgprot/hour。同时用重组蛋白免疫草鱼，采用荧光定量PCR方法分析诱导前后草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化，结果显示免疫组IgM mRNA的水平均高于对照组。Elisa分析VP5蛋白诱导产生的抗体效价，结果显示呈现阳性反应，说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。但对草鱼的保护性实验结果显示，免疫组几乎没有保护效果。本研究结果说明VP5应可在病毒内部RNA转录过程起作用，同时该蛋白具有免疫原性，但诱导产生的抗体未能为草鱼提供抗病毒保护。