本文根据GenBank中已登记N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因序列设计引物，PCR扩增得到了R2酶成熟肽编码基因。将扩增产物与pMD18-T载体连接，成功构建了重组质粒pMD18-T-R2，经过双酶切及PCR验证，证明克隆到pMD18-T载体上的外源基因即胞壁质酶R2基因。核苷酸序列测定表明，R2酶基因由655个碱基组成，与已报道的N,0-二乙酰胞壁质酶R2基因序列一致。对胞壁质酶R2基因进行了限制酶切图谱分析。 将pMD18-T-R2上的N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后，与经过相同酶切处理的pMA5载体连接，构建重组质粒pMA5-R2。然后将重组质粒pMA5-R2用SstI酶切去除与表达无关的片段，自连后，连接产物转化枯草芽孢杆菌BCL1050，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子，并将此重组质粒命名为pMA5-R2-a。在筛选到的转化子中N,0-二乙酰胞壁质酶R2基因得到了较高水平的表达，酶活达到138U/mL。对转化子pMA5-R2-a/BCL1050发酵条件进行了优化，优化后酶活可达240U/mL。与以LB为培养基相比，酶活提高了1.75倍。对重组胞壁质酶的酶学性质进行了研究，发现与天然N,0-二乙酰胞壁质酶基本一致。 通过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将N,0-二乙酰胞壁质酶R2基因按照质粒阅读框的转译方向插入到表达质粒pPIC9K的MCS中，构建重组表达质粒pPIC9K-R2。利用电转化方法转化表型为His-的毕赤酵母宿主菌株SMD1168，利用MD培养基初筛，再用MD、MM和(0.5-5mg/mL)G418的YPD平板筛选，获得1株具有4mg/mL的G418抗性，含高拷贝N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因的MutsHis+重组毕赤酵母转化子。甲醇诱导表达，溶菌酶活性为156U/mL。对重组胞壁质酶的酶学性质进行了研究，发现与天然N,O-二乙酰胞壁质酶基本一致。