宫颈癌严重威胁妇女的健康,是常见的妇科恶性肿瘤之一。据报道全球宫颈癌患者每年新增60余万例,死亡20余万例,85%新发病例集中在发展中国家。中国宫颈癌发病率约占全球新发病例的三分之一,针对宫颈癌治疗为综合治疗,主要包括手术、放疗及化疗等,目前规范的治疗方式主要是应用以铂类药物为基础的同步放化疗方案。已经能改善大部分患者的预后。然而,由于肿瘤的异质性以及患者自身情况差异,不同患者对同步放化疗的反应不同,存在放化疗治疗敏感性和耐受性差异,导致患者局部无复发生存率(LRFS)、无病生存率(DFS)、中位生存率和总生存率(OS)仍然很低。据文献报道,大约30~50%的宫颈癌患者在初始治疗结束后5年内面临复发及转移。其重要原因包括宫颈癌组织对同步放化疗治疗的抵抗。然而,产生同步放化疗抵抗的机制至今尚不明确。因此如果宫颈癌对同步放化疗治疗产生耐受性的机制得以阐明,不仅能为宫颈癌精准治疗的实施提供理论依据,也可为开发增强宫颈癌对同步放化疗治疗敏感性的治疗手段提供新思路。随着近年来对放化疗综合治疗研究的进展以及肿瘤疫苗问世,基因治疗逐渐成为治疗的新方向。目前,癌基因扩增及扩增后影响肿瘤细胞生物学行为的机制引起了国内外学者的普遍关注,对于Rsf-1/HBXAP基因的研究为其中之一。Rsf-1/HBXAP基因是一种染色质重塑因子,位于11q13.5。Rsf-1/HBXAP基因通过在细胞核内与hSNF2H(人类非糖酵解蛋白2同源物,Human sucrose nonfermenting protein-2homologue)在结合构成染色质重塑复合物而发挥作用,在复合物中Rsf-1/HBXAP基因作为组蛋白伴侣调整复合物与DNA的结合活性,同时hSNF2H具有ATP酶活性和解螺旋酶活性,能够参与核小体的移动和DNA的解螺旋过程,从而改变染色体结构或核小体位置,影响基因的转录、复制等过程。已有文献提示在肝癌、胃癌及卵巢癌等多种肿瘤组织中Rsf-1/HBXAP基因异常高表达,而其复合物(Rsf-1/HBXAP与hSNF2H结合而成)可以与细胞周期蛋白E协同作用,通过促进G1期到S期中肿瘤细胞比例增加而促进恶性肿瘤的进展。且其高表达与肿瘤恶性程度、不良预后及耐药产生正相关。在恶性肿瘤组织中,许多属于11q13.5区域的癌基因也存在扩增,包括ISWI,SWI/SNF和CHD/Mi-2家族。但是同属染色体11q13.5区域的Rsf-1/HBXAP基因在宫颈癌中是否也存在扩增并对宫颈癌进展及患者的预后产生影响在国内罕见报道。以上研究表明,对于同步放化疗治疗不敏感乃至放化疗抵抗的宫颈癌患者,我们需要寻找个体化的治疗方式。目前,应用基因治疗联合同步放化疗治疗改善宫颈癌患者预后的治疗方式逐渐引起了人们的重视。国外已经有研究利用mi RNA(微小RNA)干扰Rsf-1/HBXAP基因并进行耐药分析证实Rsf-1/HBXAP基因与宫颈癌细胞系的耐药性有关,这为妇科肿瘤的基因治疗提供了依据。除此之外,还有研究对恶性肿瘤中Rsf-1/HBXAP基因表达含量不同的患者进行了随访,发现Rsf-1/HBXAP基因的高表达情况与肿瘤的预后不良显著相关。但其具体机制仍有待研究。现在国内外关于Rsf-1/HBXAP基因与恶性肿瘤的发展及耐药性的研究仍集中在胆囊癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌中,关于宫颈癌中Rsf-1/HBXAP基因表达以及影响宫颈癌进展和同步放化疗治疗敏感性的研究少有报道。本研究将对Rsf-1/HBXAP基因在宫颈癌中表达及影响宫颈癌进展和对同步放化疗治疗敏感性的机制进行研究。【目的】为探讨Rsf-1/HBXAP基因在宫颈癌中的表达程度、影响宫颈癌的发展机制以及影响肿瘤对同步放化疗治疗敏感性机制和分子放疗、基因精准治疗提供实验基础。【方法】应用免疫组化法检测Rsf-1/HBXAP蛋白在50例宫颈鳞癌组织、35例宫颈上皮内病变(CIN)组织及14例正常宫颈组织中的表达,通过χ2检验分析不同类型的宫颈组织间、不同CIN组织之间以及不同临床病理特征的宫颈癌组织间Rsf-1/HBXAP蛋白含量的差异,通过液基薄层细胞制片技术收集并检查宫颈脱落细胞测定HPV相对含量,同时分析20例宫颈鳞癌组织在同步放化疗治疗(紫杉醇+顺铂方案联合体外适形调强放射治疗5040cGy以及腔内后装三管A点5000cGy放射治疗)前后Rsf-1/HBXAP蛋白含量的差异。应用荧光实时定量PCR技术及Western Blotting免疫蛋白印迹技术检测并分析Rsf-1/HBXAP基因在Hela、Siha以及293T细胞系之间以及宫颈癌Hela细胞系电离辐射后的表达差异。通过mi RNA干扰技术沉默宫颈癌细胞系Rsf-1/HBXAP基因并利用MTT比色法及流式细胞技术检测宫颈癌细胞系在该基因沉默后对电离辐射敏感性的变化。采用Kaplan-Meier生存分析探讨该基因的表达程度与患者预后的关系。【结果】免疫组化染色证实宫颈癌组织Rsf-1/HBXAP染色阳性表达率高于CIN组织及正常宫颈组织,其差异具有统计学意义(P<0.05)。Rsf-1/HBXAP染色在随CIN组织级别增高而增高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。Rsf-1/HBXAP表达在大体类型、瘤体直径、HPV感染、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴血管间隙浸润以及临床分期方面的差异具有统计学意义(均P<0.05),而在年龄中的差异无统计学意义(P>0.05)。Rsf-1/HBXAP基因在接受同步放化疗前的宫颈癌组织中表达与治疗后相比,有显著性差异(P<0.05)。对不同宫颈癌细胞系中Rsf-1/HBXAP mRNA以及蛋白表达水平进行分析,可见宫颈癌细胞系中Rsf-1/HBXAP mRNA以及蛋白表达丰度高于对照细胞系,同时,宫颈癌细胞系接受电离辐射后Rsf-1/HBXAP mRNA以及蛋白表达水平均低于接受电离辐射前,其差异具有统计学意义(P<0.05)。转染miR-21(微小RNA-21)后,Hela细胞中Rsf-1/HBXAP mRNA拷贝数明显减少,MTT比色法显示,转染mimics(小分子干扰RNA转染促进剂)组与NC组(对照组)之间、inhibitor组(微小干扰RNA抑制剂)与inhibitor NC组之间细胞接受电离辐射后细胞存活率之间并无显著性差异(P>0.05)。流式细胞术检测表明;HeLa细胞在接受电离辐射后凋亡率明显高于NC组。转染mimics后,与NC组相比,细胞凋亡率虽有所增加,但差异无统计学意义。inhibitor组细胞凋亡率较NC组有所下降,但其凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),而inhibitor组与mimics组Hela凋亡率相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。所有宫颈癌患者在同步放化疗治疗结束后均进行随访,按照病理切片染色评分结果分为Rsf-1/HBXAP高表达组(27例)和低表达组(23例)。两组患者中各有2例患者在随访期间去世,Rsf-1/HBXAP高表达组和低表达组生存率差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.Rsf-1/HBXAP基因在宫颈癌组织及其细胞系中高度表达,预示其可能在宫颈癌组织中存在扩增,从而影响宫颈癌的进展;2.宫颈癌组织中Rsf-1/HBXAP基因的表达在接受放化疗前后的差异具有统计学意义,表明该基因可能影响宫颈癌对放化疗治疗的敏感性;3.沉默宫颈癌细胞系Rsf-1/HBXAP基因可导致宫颈癌细胞系对电离辐射敏感性增加,提示Rsf-1/HBXAP基因可能为宫颈癌放射治疗抵抗性产生的原因之一;4.Rsf-1/HBXAP基因高表达组患者生存率明显低于低表达组,表示该基因可能导致宫颈癌的复发及转移;5.本研究为该基因作为早期协助诊断宫颈癌、判断患者预后以及指导临床制定并实施宫颈癌个体化治疗方案提供了实验基础。