研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一个全球性的健康问题。糖尿病作为早产和死亡的主要原因,能够增加心血管疾病的患病风险,导致心肌重塑和心力衰竭。心肌纤维化是伴随糖尿病常见的一种病理过程,在心血管疾病的发病机制中起关键作用。心肌纤维化导致心肌重构,增加心肌的僵硬度,降低心脏泵送能力,最终导致心力衰竭。然而,迄今为止还没有针对心肌纤维化的有效治疗方法。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)是心脏中的主要细胞类型,在正常的心脏中负责基底细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的沉积和降解。作为基质的主要分泌细胞,心肌成纤维细胞是参与心肌纤维化至关重要的环节。心肌成纤维细胞在各种刺激下能够发生一系列变化,如增殖、迁移、细胞分化、生成和降解细胞外基质,分泌细胞因子和生长因子等。高糖(high glucose,HG)是糖尿病的主要特征,已被证实在体外能够诱导心肌成纤维细胞增殖和活化以及刺激胶原的沉积。在这些概念的基础上,针对心肌成纤维细胞活化抑制心肌纤维化的治疗是可靠的战略要点。"莲子心",来自中国植物莲种子的胚,是一种中医常用的镇静、解热、止血剂。甲基莲心碱是来自莲子心的一种双苄基异喹啉类生物碱,与莲心碱和异莲心碱同分异构。到目前为止,各种研究表明,甲基莲心碱具有多种生物活性和药理作用,如抗高血压、抗心律失常,抗凝集、抗血栓形成,抗氧化,抗炎,抗癌能力,负性肌力作用和松弛血管平滑肌等。研究发现,甲基莲心碱不仅具有抗肝纤维化的作用,还能够减轻博莱霉素诱导的体外和体内的肺纤维化,对胺碘酮导致的肺纤维化同样具有显著的抑制作用。最近的一项研究表明,甲基莲心碱可以减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化,并能够降低肝内的转化生长因子β 1(TGF-β 1)。因此,我们当前研究的目的是明确甲基莲心碱能否减轻高血糖所致的心肌纤维化并深入探讨其分子机制,以期提供可供选择的、安全的临床药物。研究目的1.研究甲基莲心碱对糖尿病小鼠心肌纤维化的作用及机制;2.研究甲基莲心碱对高糖刺激心肌成纤维细胞增殖、迁移及合成胶原能力的影响。研究方法第一部分1.动物模型建立及甲基莲心碱体内给药将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为STZ组(45只)和正常对照组(15只)。造模方法为:连续腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)溶液5天,用药剂量为60mg/kg/d,通过此方法诱导模型组小鼠产生糖尿病。对照组小鼠根据STZ用药的剂量、体积相应注射同体积的无菌柠檬酸盐缓冲液(PH 4.5),浓度为0.1mmol/l。注射STZ溶液1周后,尾静脉取血测量小鼠随机血糖,并且将尾静脉随机血糖浓度大于18mmol/l的小鼠纳入糖尿病模型组,并随机分为3组:甲基莲心碱低剂量组(60mg/kg/d)、甲基莲心碱高剂量组(120mg/kg/d)、模型组。甲基莲心碱药物从实验第4周末开始以灌胃的方式给药,每日两次,对照组给予等量的生理盐水灌胃。2.血压和心率检测在小鼠取材前,应用tail-cuff方法,于安静、保暖状态下测量3次以上小鼠的尾静脉收缩压、舒张压、平均动脉压和心率,取其平均值统计。3.超声心动图检测心功能小鼠取材前,选用专业人员运用二维、M超、脉冲多普勒和组织多普勒超声成像技术评价小鼠的心脏左室功能。4.透射电镜观察心肌的超微结构将新鲜的心脏迅速取出,左心室切割成1mm3的块状,以备透射电镜观察。5.组织学染色用甲醛固定小鼠心脏,经冲洗、脱水、石蜡包埋后制备石蜡切片,常规脱蜡后进行天狼猩红、HE、Masson染色,观察心脏的大体形态和胶原含量。通过免疫组织化学染色,观察心肌组织内因子的分布和表达情况。第二部分1.细胞培养本实验利用刚出生1～3天的C57小鼠的心脏,采用心脏分离和培养的方法得到左室心肌成纤维细胞。2.实时定量RT-PCR提取组织和细胞RNA进行逆转录,利用实时定量RT-PCR方法测定组织和细胞的mRNA水平。3.蛋白免疫印迹收集细胞进行蛋白提取,按标准步骤进行试验。4.细胞的增殖和迁移实验采用CCK-8试剂盒测定细胞的增殖率,利用Transwell小室观察细胞的迁移情况。5.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理实验数据,图示中连续变量以平均数土标准差表示。多组间的变量运用单因素方差分析检验。P小于0.05认为有统计学意义。研究结果第一部分1.小鼠的一般特性经过STZ诱导、普通饮食后,糖尿病小鼠随机血糖明显高于正常对照组小鼠。糖尿病小鼠收缩压、舒张压、平均动脉压明显高于正常对照组小鼠,心率低于正常小鼠。然而,低剂量或高剂量的甲基莲心碱药物干预,对上述指标没有明显作用,说明甲基莲心碱改善糖尿病心肌病并不是通过降低血糖实现的。2.甲基莲心碱能够减轻糖尿病小鼠的心肌重塑及心功能异常体内实验中,高、低剂量的甲基莲心碱给药12周,观察四组小鼠左心室肥大情况。糖尿病组小鼠与正常组小鼠比较表现为心脏变大、心尖圆钝。给予甲基莲心碱药物组小鼠心脏大小、形态明显改善。通过测量心、肺重量及胫骨长度,甲基莲心碱药物降低了糖尿病小鼠的心脏胫骨重量长度比(HW/TL)和肺脏胫骨重量长度比(LW/TL),减少心肌细胞面积。与正常组小鼠相比,糖尿病组小鼠心肌线粒体形态学改变,呈现嵴碎裂和无序的Z-线结构。低剂量或高剂量的甲基莲心碱治疗减轻线粒体肿胀、嵴碎裂和Z线结构损伤。超声心动图显示糖尿病小鼠心功能下降,左心室射血分数(LVEF),短轴缩短率(FS)和早晚期二尖瓣流入血流速度比(E/A)均降低,而甲基莲心碱治疗可提高上述心功能参数,改善糖尿病小鼠心功能。3.甲基莲心碱能够减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化Masson染色以及天狼猩红染色显示糖尿病小鼠出现明显的心肌纤维化;根据免疫组织化学染色和免疫印迹技术显示糖尿病小鼠左心室心脏组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原和TGF-β 1表达增加;甲基莲心碱能够减低心肌组织胶原含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原和TGF-β 1表达。4.甲基莲心碱减轻糖尿病小鼠心肌组织ICAM-1、VCAM-1、TNF-α的表达蛋白质印迹结果显示,与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠炎症因子TNF-α、促炎因子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达显著增多。低或高剂量的甲基莲心碱干预后,糖尿病小鼠心肌组织TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的表达明显减少。第二部分1.甲基莲心碱抑制高糖刺激的心肌成纤维细胞的增殖高糖(30mmol/l)刺激心肌成纤维细胞作用不同的时间(24h、48h、72h),与正常对照组相比,均能促进心肌成纤维细胞的增殖,分别用不同浓度的甲基莲心碱(1 μM,2 μM,5 μM)干预,均能够抑制高糖刺激的成纤维细胞的增殖,其中2uM和5μM浓度具有统计学意义。2.甲基莲心碱将心肌成纤维细胞的增殖生长周期阻滞在G1期高糖促进心肌成纤维细胞从G1期向S期改变,甲基莲心碱(2 μ M,5 u M)作用48h后能够增加G1期细胞比例,减少S期及G2期细胞比例。3.甲基莲心碱降低高糖诱导的心肌成纤维细胞胶原的分泌,减少TGF-β1的表达,抑制心肌成纤维细胞的迁移甲基莲心碱能够抑制高糖刺激心肌成纤维细胞的胶原Ⅰ、胶原Ⅲ和TGF-β1的分泌,抑制高糖刺激的心肌成纤维细胞的迁移。4.甲基莲心碱作用于心肌成纤维细胞的相关信号通路免疫印迹显示高糖刺激的心肌成纤维细胞Smad2/3、ERK1/2及p38的磷酸化水平增高,甲基莲心碱处理能够降低细胞Smad2/3、ERK1/2及p38的磷酸化水平。研究结论1.甲基莲心碱能够改善糖尿病小鼠心肌重构、心功能障碍及心肌纤维化程度;2.甲基莲心碱能够减轻糖尿病小鼠心脏炎症反应;3.甲基莲心碱能够抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞的增殖、迁移及胶原分泌,抑制心肌成纤维细胞的活化;4.甲基莲心碱通过抑制TGF-β 1/Smad2/3、ERK1/2和p38磷酸化水平进而改善糖尿病心肌病。