卵巢卵泡发育包括启始、募集、选择、优势化、排卵和黄体化等环节。该过程受激素、生长因子、金属离子等多种因素控制,最终只有少数卵泡发育为优势卵泡并排卵,99%以上的卵泡发生闭锁。太湖猪是我国四大著名地方猪种之一,二花脸猪是太湖猪的七大类群之一,以产仔率高、母性好、耐粗饲、肉质鲜美而闻名于世。虽然有关二花脸猪的繁殖特性观察已见报道,但是与其繁殖相关的细胞生物学知识研究还很有限。原始卵泡库的数量是决定雌性动物繁殖年限,卵母细胞的数量决定着雌性哺乳动物的繁殖力。原始卵泡的形成过程也就是人们熟知的卵泡组装,在组装过程中,卵母细胞完成有丝分裂并进入减数分裂阶段,原始卵泡就此形成。啮齿动物卵泡的形成发生在出生后,而猪、牛、羊、和人类等动物的原始卵泡形成在出生前的胎儿时期。近年来的研究表明,类固醇激素、PI3K/Akt和NO/sGC/cGMP等多条信号通路均在小鼠、大鼠、牛等动物的卵巢卵泡形成过程中发挥重要的调控作用。但是关于上述通路在猪的卵巢卵泡形成和早期发育过程中的作用还鲜有报道。因此,深入研究猪卵巢细胞的生物学特性及相关信号通路在卵泡发育中的作用,对提高母猪繁殖力方面具有重要意义。本论文以二花脸猪为研究对象,重点研究了胎猪和新生仔猪卵巢卵泡发育的组织学变化,观察到二花脸猪原始卵泡形成的时期和卵泡早期发育的关键阶段；以免疫组织化学和化学发光法研究了胎儿和新生期猪卵巢组织中雌激素和孕激素含量变化对卵巢卵泡形成和早期发育的影响；以免疫组织化学和蛋白印迹方法研究了PTEN/PKB/FOXO信号通路中相关蛋白在卵巢卵泡形成和早期发育中的表达；同时还对NOS信号通路的相关蛋白在卵巢卵泡形成和早期发育中的作用进行研究。1.二花脸猪卵巢卵泡形成与早期发育为了研究二花脸猪卵泡的形成和发育特点,取胎儿期50、70和90(日龄)、新生1日龄及生后期20、70和120(日龄)7个阶段猪的卵巢组织样进行组织学观察。结果表明,生殖细胞在早期卵巢中以卵母细胞巢状结构存在,原始卵泡最早出现在胎70日龄卵巢中,黄体出现在生后120日龄；以Stat3为生殖细胞的标记蛋白,进行免疫组织化学观察,统计出生前期各日龄阶段卵母细胞巢和卵泡的比例。结果表明,从胎70日龄到胎90日龄,卵母细胞巢状结构比例显著降低,单个卵泡比例显著增高,生后70日龄卵巢中出现有腔卵泡,未见黄体出现,生后120日龄卵巢中出现黄体；以PCNA作为细胞增殖的指标,进行卵巢组织的免疫组织化学定位,结果显示,在猪的卵泡形成和早期发育阶段以卵母细胞的快速增殖为主。说明二花脸猪的卵巢原始卵泡开始形成的时间在胎猪70日龄左右,初情期在生后70-120日龄,卵泡激活前以卵母细胞的生长为主。2.猪卵巢卵泡早期发育过程中雌激素和孕激素含量变化及其受体的表达定位为了研究在猪卵巢卵泡形成和早期发育过程中卵巢组织雌激素和孕激素含量的变化,分析激素和卵泡形成与发育之间的关系,本试验以胎猪和新生仔猪为试验动物,通过免疫组织化学方法对胎猪和新生仔猪卵巢组织中的雌激素和孕激素受体进行定位,结果表明：在猪早期阶段卵巢中雌激素受体(ER)主要分布在卵巢表皮细胞、卵母细胞巢中的卵原细胞和卵母细胞以及原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞的核中；孕激素受体(PR)主要分布在卵巢表皮细胞、卵母细胞胞核以及原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞的核中；应用化学发光法对胎猪和新生仔猪的卵巢组织和血清中的雌激素及孕激素进行测定,结果表明：随着胎龄的增加,卵巢匀浆液中的雌激素和孕激素水平下降。通过雌激素和孕激素水平与猪的卵泡形成的相关性分析,结果表明：卵巢组织中的雌激素和孕激素含量与卵泡的形成和发育具有显著的负相关。这预示出生前猪卵巢组织中的雌激素和孕激素含量变化可能影响猪卵巢卵泡的形成和早期发育。3. PTEN、PKB、FoxO3a和FoxO1蛋白在猪卵巢中的表达定位为了研究PTEN/PKB/FOXO信号通路在早期卵泡发育过程中的作用,本研究采用免疫组织化学方法对PTEN、PKB、FoxO1和Fox03a蛋白在猪卵巢中的表达进行了细胞定位,结果表明：在胎儿和新生期,PTEN、PKB、FoxO1和FoxO3a主要在卵母细胞巢中的卵原细胞、原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞和血管内皮细胞的胞质等部位表达；在生后期,PTEN、PKB、FoxO1和Fox03a,主要在腔前卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞层、基底层、膜细胞层、黄体细胞和卵母细胞胞质中表达,其中FoxO1在颗粒细胞层的表达最为明显。应用免疫蛋白印迹方法对PTEN、PKB和Fox03a蛋白在胎猪卵巢中的表达进行了检测分析,三种蛋白在胎猪卵巢中均有表达。说明：PTEN/PKB/FOXO信号通路可能在卵泡的早期形成、生长和黄体化过程中具有调节作用。4. PTEN和FoxO3a蛋白在不同直径猪卵泡颗粒细胞的表达为了研究PTEN和FoxO3a在不同卵泡颗粒细胞中的表达情况,本实验用机械法从猪卵巢分离卵泡,按直径大小分为2组：小卵泡(1.5-3 mm)和大卵泡(≥5mm),分别统计健康卵泡比率,分离颗粒细胞并收集卵泡液。用台酚蓝排斥实验检测颗粒细胞的存活率,用Western blot检测不同直径卵泡颗粒细胞内FoxO3a、pAKT和PTEN表达水平,结果表明：随卵泡直径的增大,健康卵泡比率增加(P<0.05)；颗粒细胞存活率升高(P<0.05)；颗粒细胞内FoxO3a和PTEN表达水平升高(P<0.05), pAKT表达水平降低(P<0.05)；用化学发光法检测不同直径卵泡液中E2的浓度,结果表明：随卵泡直径的增大,卵泡液中E2的浓度升高(P<0.05)。这预示着PTEN和FoxO3a蛋白在不同直径有腔卵泡颗粒细胞中的表达差异可能通过影响颗粒细胞生长和凋亡来调节卵泡发育与闭锁。5.NOS和sGC蛋白在猪卵巢中的表达定位为了研究NO/sGC/cGMP信号通路相关蛋白在猪卵巢卵泡形成和发育过程中的作用,本实验应用免疫组织化学方法对猪卵巢组织进行三种一氧化氮合酶(eNOS、iNOS和nNOS)和可溶性鸟苷酸环化酶(sGCal和sGCβ1)进行定位,结果表明：三种NOS在猪卵巢卵母细胞巢、各级卵泡卵母细胞、卵巢表皮细胞、血管内皮细胞和黄体的胞质中均有表达。在生长卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞层和膜细胞层也有表达,在颗粒细胞和膜细胞中的表达随着卵泡的发育而逐渐增强；sGCα1和sGCβ1在卵巢的卵母细胞巢、原始卵泡及小的发育卵泡的颗粒细胞、血管内皮细胞中表达,在有腔卵泡的基膜细胞和黄体细胞中也有适度表达。此外,在90胎龄和新生1日龄卵巢组织中的原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞中的表达强度极高,而随着卵泡尺寸的增大,其表达强度逐渐降低。卵巢中NOS的活性测定结果表明：TNOS、eNOS和iNOS含量在出生前期显著高于出生后期(p<0.05), nNOS含量在出生前期和出生后期之间差异不显著(p>0.05)。这表明NO/sGC/cGMP通路在卵泡的早期发育过程中发挥一定的作用。综上所述,卵巢卵泡形成和早期发育是一个复杂的生理过程,多个因素在该过程中起作用。本试验结果表明二花脸猪的卵巢原始卵泡是在胎儿期形成的,类固醇激素、PTEN/PI3K/Akt/FOXO和NO/sGC/cGMP等信号通路可能在猪的原始卵泡形成和早期发育过程中发挥重要的的作用,而上述通路的具体调控机制还需要进一步研究。