GroEL属于分子伴侣(molecular chaperone)中的伴侣素蛋白(chaperonin)家族,由于与真核生物中广泛存在的HSP60无论在结构还是功能上都几乎一致,因此,其亦被称为热激蛋白。GroEL是一类作用比较广泛的伴侣蛋白,其通常在胞内帮助许多蛋白进行折叠、成熟和转运。在E.coli中,约有10％-15％的蛋白是依赖于GroEL进行折叠的,因此其在任何温度下都是菌体正常生长所不可或缺的。GroEL有如下三大特征:1)序列的保守性:GroEL在真核生物、原核生物及古细菌中广泛存在,且其在进化上高度保守,不同的种属之间的CroEL表现出了极大的序列相似性,如:人类的HSP60与细菌的GroEL之间有超过55％的相似性,这一特性使它作为分类的依据逐渐被应用到系统发生分析的工作中,以弥补16SrRNA在种水平上分辨率的不足；2)多拷贝性:在大约20％已经测序的细菌基因组中都存在两个或者两个以上拷贝的groELs。groELs的多拷贝化源于进化过程中基因的复制和水平转移,而伴随着这一过程的便是GroEL功能分化及多样性,此即为GroEL的第三大特征。GroEL功能的多样性往往具有菌株特异性,如在分支杆菌(Mycobacteria)的基因组中存在两个拷贝的groELs,其中,groEL2是发挥持家功能的伴侣蛋白,因而是细胞正常生存所必须的,groEL1参与了霉菌酸(Mycolic Acid)的合成,当其失活后,菌体虽然还能够生存,但是不能生成成熟的生物膜；苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)基因组中有多达5个拷贝的groELs,其中groESL1与共生密切相关,是持家的分子伴侣,而groESL5则主要参与应激反应。　　 GroEL蛋白是一个由两个背靠背的环组成的桶状结构,其中每个环由7个相同的60kDa亚基组成,14个亚基包裹的空腔构成了对底物蛋白进行折叠的圆桶状的“加工室”,其辅伴侣蛋白(co-chalperone)GtoES是一个由7个约10kDa的亚基组成的同聚体蛋白,结构上如同一个中部凸起的“房顶”,行使功能时,其像一个盖子一样将OroEL顶部密闭。GroES同GroEL的结合一方面增大了GroEL折叠容量,另一方面,通过引发一系列的变构效应从而帮助GroEL完成对底物蛋白的释放,因而在经典模式中,GroES是GroEL助折叠机制中非常关键的一个因素。　　 通常情况下,groEL基因前端存在groES辅伴侣蛋白基因,以groESL操纵子的形式存在。然而,在具有多个拷贝groELs基因的基因组中,groEL并不都是以完整的groESL操纵子的形式存在,也就是说,某些拷贝groEL前端丢失了groES基因,于是有推测认为,groES基因的丢失是因为GroEL进化出了不依赖于GroES的作用方式。事实上,多种GroELs共用同一个groES基因的蛋白产物而发挥功能也可能导致某些拷贝groES基因的丢失,但这点尚未为实验证据所证实。　　 前期本实验室在对纤维堆囊菌进行种水平上的分类工作中引入了groELs作为分类尺度,分析发现黄色粘球菌(M.xanthus)DK1622基因组中分布有两个拷贝的groELs,当分别用两个拷贝作为分类指标进行分类时,它们之间不会相互混杂,这提示了它们在进化上似乎是独立的,因此二者的功能可能存在潜在的差异。进一步生物信息学分析表明,两个拷贝基因的差异体现在诸多方面,首先:在组成结构上,groEL1前端存在groES辅伴侣蛋白基因,以典型groESL操纵子的形式存在,而groEL2上游则缺失了groES基因,取而代之的是分布于其上下游的应答调控元件；其次,在核苷酸和氨基酸序列组成上,两个拷贝分别有78.94％和83％的同源性,显示出一些差异；再次,在可能的调控机制方面,groEL1基因簇前端存在两个非常保守的CIRCE(Controlling Inverted Repeat for ChaperoneExpression)负调控元件,而groEL2在缺失groES时将其一并丢失,但其上下游却广泛分布有应答调控元件。这些现象进一步加深了我们对于黄色粘球菌DK1622双拷贝groELs基因差异性的认识。　　 本研究以黄色粘球菌DK1622双拷贝groELs基因作为研究对象,通过对两个基因进行缺失、构建基因回补-失活突变株及报告基因融合表达菌株等方法,对两个基因在菌株的生长、应激等基本生物学过程及运动、摄食和发育等多细胞群体行为中的功能进行了考察,揭示了两个拷贝groELs在粘细菌生活史中的功能及相互关系。进一步结合相容性质粒共表达和基因串联表达的方法建立了黄色粘球菌DK1622和纤维堆囊菌0157-2的CroEL助溶体系,并利用粘细菌来源的HrcA蛋白作为助溶的模式底物,揭示了粘细菌中双拷贝groELs共用同一个groES辅伴侣蛋白基因的可能性及两种GroEL之间可能存在的底物特异性。　　 在黄色粘球菌DK1622的生长和应激反应方面,两个拷贝groELs之间体现出了一定的协作性。基因失活的实验结果表明,两个拷贝groELs基因可以被分别失活；但两个基因的双失活对菌体是致死的,除非存在回补的groEL拷贝,否则双拷贝groELs不可被同时失活,因此任意一个拷贝groEL基因的存在是维持菌体存活所必须的。实时荧光定量PCR的结果进一步显示,两个基因在生长时期均表达,且除延迟期初期外,groEL1的表达量在生长阶段的各个时期均较groEL2高；groEL1基因的敲除会引发groEL2基因的上调表达,这可能是单基因失活菌株的生长并未受到显著影响的因为之一；而在groEL2敲除的菌株中,groEL1的下调表达会导致菌体的生长产生较为显著地延迟,这些结果提示,双拷贝groELs基因均参与了菌株的生长过程,且二者在生长过程中的功能具有一定的互补性。应激反应方面,二者均参与了冷、热、醇类、渗透压、盐等胁迫反应,在不同的胁迫条件下它们都表现出了不同程度的上调表达；在热激反应中,groEL2缺失会使菌体对热激较野生型更为敏感,而groEL1缺失却使菌体基本丧失对热激的耐受性,但groEL1并不能使groEL2敲除菌株在受到热冲击后保持同野生型菌株同样的长势,因而对于热激反应,两个拷贝groELs基因的功能具有部分叠加。　　 两个拷贝groELs基因功能的分化体现在多细胞群体行为中。在发育方面,groEL1缺失会导致菌体的生孢和发育产生严重缺陷,而groEL2则不然；在所选取的各个发育时间点,groEL1的表达量普遍较groEL2高,相对而言,groEL2在发育阶段的表达更为恒定；将groEL2进行过表达能够部分回复菌体的生孢和发育能力,但是仍然不及野生型菌株,因此,二者在生长阶段表达量的差异是它们产生功能差异的因为之一。运动方面,groEL1缺失会部分削弱菌体的A运动,无论groEL1还是groEL2的缺失都不影响菌体的S运动。摄食方面,groEL2缺失导致菌体对活菌的摄食能力受到显著削弱,在以干酪素为营养的培养基中,groEL2敲除菌株的生长也较野生型菌株缓慢。因此,在粘细菌多细胞群体行为中,双拷贝groELs具有一定的分工,groEL1参与了菌体的A运动,是菌体正常发育所必需的；groEL2则是菌体摄食不可或缺的。　　 在构建GroE1共表达助溶体系的过程中,比较分析了基因共表达的三种策略,即:不相容质粒共表达、同一启动子串联共表达和相容性质粒共表达的优劣,结果表明,利用带有不同抗生素抗性的不相容质粒进行基因共表达的稳定性较差,利用同一个启动子进行基因的串联共表达对于两个基因是有效的,相容性质粒是进行基因共表达的最佳选择。本实验中结合相容性质粒和基因串联表达的方法初步建立了粘球菌DK1622和堆囊菌0157-2的GroEL助溶体系,并利用该体系成功实现了粘球菌DK1622来源HrcA蛋白的助溶,并克服了其二价金属离子敏感性。此外,利用HrcA蛋白作为模式底物,利用蛋白体内助溶、体外蛋白复性、非变性凝胶电泳及基因敲除等方法首次证明了在具有多个groELs拷贝的菌中,两个拷贝groELs共用同一个groES而发挥功能及两种GroELs之间存在的底物特异性。