论文部分内容阅读
感染是肾移植术后主要的并发症,也是导致移植肾功能不全的病因之一。巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)是导致感染的重要病原体之一。人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)匹配程度是决定肾移植成功与否的关键,同时MHC自身也是抗病毒细胞免疫中的重要分子。本研究观察肾移植术后CMV感染时非经典MHCⅠ类分子中的人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)表达变化,分析CMV感染对受者移植肾功能和免疫状态的影响,验证CMV UL111A基因编码的病毒白介素-10(cytomegalovirus encoded interleukin-10,cmvIL-10)对靶细胞HLA-G表达的影响,初步探讨CMV可能的免疫逃逸机制。本研究纳入解放军总医院第八医学中心初次行同种肾移植的受者59例,根据感染情况分组:CMV-DNA载量>1×10~3 copies/ml,CMV-DNA(+)组(n=29);CMV-DNA载量<1×10~3 copies/ml,CMV-DNA(-)组(n=30);另纳入30例健康人作为健康对照组(H组)。统计分析各组血肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)值得出,CMV-DNA(+)组的Scr值为245.47±168.33μmol/ml,显著高于CMV-DNA(-)组(105.21±43.28μmol/ml,P<0.001)和H组(55.10±13.45μmol/ml,P<0.001);BUN值为18.49±13.70μmol/ml,亦显著高于CMV-DNA(-)组(10.02±6.13 mmol/ml,P=0.001)和H组(4.31±1.41 mmol/ml,P<0.001),提示CMV感染是导致移植肾功能不全的病因之一。通过流式细胞术检测各组淋巴细胞亚群数量,结果如下:CMV-DNA(+)组受者总T细胞、CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD8~+T细胞、B细胞、NK细胞数量和CD4~+/CD8~+细胞比值分别为:405.64±370.09 cells/μl,184.99±184.57 cells/μl,195.74±203.18cells/μl,101.25±115.22 cells/μl,53.10±51.86 cells/μl和1.13±0.71,均显著低于CMV-DNA(-)组(1330.62±594.57 cells/μl,P<0.001;737.57±402.45 cells/μl,P<0.001;551.05±240.74 cells/μl,P<0.001;192.58±142.54 cells/μl,P=0.004;131.11±96.21 cells/μl,P=0.002;1.42±0.70,P=0.017)和H组(1463.64±352.10 cells/μl,P<0.001;827.94±232.53 cells/μl,P<0.001;605.02±191.45 cells/μl,P<0.001;248.39±160.76 cells/μl,P<0.001;295.20±225.08 cells/μl,P<0.001;1.47±0.47,P=0.013),说明CMV-DNA(+)组受者免疫功能显著下降。应用ELISA法检测血清中可溶性HLA-G分子G5(souble human leukocyte antigen-G5,sHLA-G5)和白介素-10(interleukin-10,IL-10)的表达得出,CMV-DNA(+)组的sHLA-G5水平为124.29±71.82 U/ml,显著高于CMV-DNA(-)组(35.22±25.23 U/ml,P<0.001)和H组(39.74±21.18 U/ml,P<0.001);IL-10水平为67.22±69.09 U/ml,亦显著高于CMV-DNA(-)组(15.17±37.61 pg/ml,P<0.001)和H组(28.74±11.89 pg/ml,P<0.001)。说明具有免疫抑制特性的sHLA-G5和IL-10表达增加可能与CMV感染的发生风险有关。在体外实验中,我们培养了CMV易感的人肾近曲小管上皮细胞系HK-2细胞。当细胞生长至80%融合后,分别将含CMV UL111A基因的EGFP标记质粒和仅含EGFP标记的对照质粒转染至HK-2细胞中,作用48小时后分别用Trizol法和RIPA强裂解液提取细胞RNA和蛋白。通过反转录PCR将提取的细胞RNA反转录为cDNA,实时定量PCR检测到与转染对照质粒的细胞相比,转染UL111A的细胞HLA-G mRNA水平显著升高(P=0.009);蛋白印迹法检测到与转染对照质粒的细胞相比,转染UL111A的细胞HLA-G蛋白水平亦增高(P=0.023)。证实CMV UL111A基因编码的cmvIL-10能够在转录和翻译水平上调HLA-G表达,这可能是CMV实现免疫逃逸的途径之一。综上,本研究发现肾移植受者CMV感染时,sHLA-G5显著增高。这可能是CMV在体内潜伏性或活动性感染的机制之一,为CMV感染的诊断和防治提供重要依据和思路。在体外实验中,CMV UL111A基因转染后,HK-2细胞HLA-G表达水平升高,提示cmvIL-10可能通过促进HLA-G的表达实现病毒免疫逃逸,为进一步研究CMV免疫逃逸的可能机制提供了新的方向。