当mRNA上的终止密码子UAA,UAG或者UGA到达核糖体的A位点时,被肽链释放因子识别,蛋白质翻译终止。真核生物中,有两类肽链释放因子参与翻译终止过程,分别为eRF1和eRF3,但具体的机制尚不完全确定。大多数高等真核生物eRF1能识别三个终止密码子,而纤毛虫eRF1却只能识别三个终止密码子中的一个或两个,称为密码子识别特异性eRF1。研究显示第一类肽链释放因子的N结构域负责终止密码子的识别,其包含3个高度保守的模体结构域：GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。纤毛虫eRF1识别终止密码子的特异性是否受到N端三个保守模体或其中关键氨基酸的调控,以及三个模体结构之间的关系是值得探讨的问题,结果有助于进一步阐明肽链释放因子识别终止密码子的分子机制。本实验首先构建了嗜热四膜虫(Tetrahymena) eRFlN端结构域与酵母的M、C端结构域组成的嵌合体eRFl(Tt/Sc eRFl)。利用双荧光素酶报告体系,在eRF1基因敲除的酵母细胞株中测定嵌合体Tt/Sc eRFl识别终止密码子的性质和活性,结果显示,Tt/Sc eRFl对终止密码的识别具有一定的特异性,即对UAA和UAG的通读效率明显高于UGA,与四膜虫eRF1的性质一致(对UGA、UAG、UAA的通读效率分别为2.49%、4.07%、10.12%)。为了分析eRF1中影响终止密码子识别性质的关键模体和氨基酸,我们通过定点突变的方法将嵌合体Tt/Sc eRFl的N结构域中保守模体的一些关键氨基酸,突变为酵母eRF1相应的氨基酸。结果显示,TASNIKS模体内的突变K57T/T59S/D63S使嵌合体eRF1对UGA.UAG通读效率比野生型分别提高了13.45%、1.84%,对UAA的通读效率降低了3.48%；YCF模体内的突变F125L/S128N使嵌合体eRF1对UGA的通读效率提高了3.04%,对UAG、UAA通读的效率分别降低了1.89%、6.72%,说明关键模体内氨基酸的改变对四膜虫eRF1识别终止密码子的性质产生了不同程度的影响,说明这些氨基酸可能通过影响模体的结构改变了eRF1对密码子的识别活性。为了分析保守的模体结构或模体间的协同作用对eRF1性质的决定作用。我们进一步利用搭桥PCR的方法将原生动物蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambiia)和嗜热四膜虫eRF1中保守模体及其相邻区域的氨基酸分别引入酵母eRF1中,构建成由不同模体组合而成的杂合N端嵌合体,以此探究eRF1的N端区域中关键模体对eRF1识别终止密码子特异性的影响。构建的贾第虫与酵母eRF1杂合的N端嵌合体为G1(1-84aa)/Sc(76-149aa)-N 和 Sc(1-75aa)/G1(85-157aa)-N;四膜虫与酵母eRF1的N端嵌合体为Tt(1-77aa)/Sc(76-149aa)-N、Sc(1-75aa)/Tt(78-151aa)-N； Sc(1-38aa)/Tt(41-77aa)/Sc(76-149aa)-N、Tt(1-40aa)/Sc(39-75aa) /Tt(78-151aa)-N。其中1-40aa包含GTx模体,41-77aa包含TASNIKS模体；78-151aa包含Y-C-F模体。同时,对N端结构域嵌合体中的一些关键的氨基酸位点进行突变,构建成N端嵌合体的突变体。将上述N端嵌合体及其突变体基因亚克隆至酵母表达载体pDB0948中。转化第一类肽链释放因子基因敲除的酵母菌株YDB447、利用双荧光素酶报告系统和质粒洗牌技术,分析了这些不同的N端结构域嵌合体eRFl识别终止密码子的性质。结果显示,G1/Sc-N对UGA、UAG通读效率分别提高了12.80%、0.81%,而对UAA的通读效率降低了3.54%；Sc/G1-N对UGA、UAG、UAA的通读效率较野生型分别降低了3.03%、2.92%、5.69%。贾第虫的eRF1的N端结构域中引入TASNIKS模体,Sc/G1-N对于eRF1识别三个终止密码子的效率都有所提高,而引入Y-C-F模体,G1/Sc-N对于终止密码子中第二位碱基的识别有所影响。引入四膜虫eRF1的模体,Tt/Sc-N eRF1对于三个终止密码子UGA、UAG和UAA的通读效率很高,分别达到了26.39%、8.02%、10.75%,不能识别终止密码子；Sc/Tt-N eRF1对三个终止密码子的通读效率都相对较低,分别为3.97%、2.09%、3.20%,即能够同时识别三个终止密码子,由此推测GTx和NIKS模体可能决定eRF1对UAG和UAA的识别。综上结果表明,四膜虫N端结构域中GTx和NIKS模体一定程度决定eRF1识别终止密码子第一位碱基U和第二位碱基A；Y-C-F模体决定eRF1识别终止密码子UGA的第二位碱基G。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了重要的数据支持。