【摘 要】
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在能源和环境危机日益加剧的今天,国内外研究热点之一是获取高效的纤维素乙醇的生产菌株。作为天然的纤维素乙醇发酵菌株,树干毕赤酵母代谢具有碳源代谢范围广、乙醇得率高、代谢副产物少等优势。然而,树干毕赤酵母在实际乙醇生产过程中存在诸多问题,如底物吸收速率低、发酵乙醇需要严格控制溶氧水平、对产物乙醇的耐受性低等。因此,需要搭建一个系统的平台对树干毕赤酵母的生理特性和代谢能力进行研究。为此,通过全基因组序列
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在能源和环境危机日益加剧的今天,国内外研究热点之一是获取高效的纤维素乙醇的生产菌株。作为天然的纤维素乙醇发酵菌株,树干毕赤酵母代谢具有碳源代谢范围广、乙醇得率高、代谢副产物少等优势。然而,树干毕赤酵母在实际乙醇生产过程中存在诸多问题,如底物吸收速率低、发酵乙醇需要严格控制溶氧水平、对产物乙醇的耐受性低等。因此,需要搭建一个系统的平台对树干毕赤酵母的生理特性和代谢能力进行研究。为此,通过全基因组序列注释构建了树干毕赤酵母的基因组规模代谢网络模型,运用基于约束的分析算法对所构建的模型进行模拟和分析（干实验）,并运用比较基因组学的方法对树干毕赤酵母的转录调控机制进行了初步研究。主要研究结果如下：1.从数据库中下载己公布的树干毕赤酵母全基因组氨基酸序列,通过BLAST和KAAS的基因组注释方法,采用自行编写的基于Matlab的程序,整合生化数据库和文献数据,构建树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型iTL885。所构建的模型包括1240个反应、870个代谢物和885个基因,分布于细胞质、线粒体和胞外三个细胞区间。iTL885中注释出的基因数占基因组基因总数的15.2%,有基因注释的反应占总反应数的92%。2.从糖类转运、代谢途径注释、细胞生长表型模拟和必需基因鉴定四个角度分析了树干毕赤酵母对不同碳源的代谢能力,深入解析了树干毕赤酵母生理特性：①采用整合测序信息、转录表达数据和实验数据的基因再注释方法获得36个糖转运子；②基于基因注释结果,借助Illustrator绘制出纤维素水解液中戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）的核心代谢途径；③运用FBA分析木糖、葡萄糖和鼠李糖三种碳源上细胞生长表型,表明葡萄糖和木糖能发酵生成乙醇,鼠李糖则是不可发酵碳源；④运用单基因敲除算法预测在葡萄糖基本培养基上有130个必需基因,占模型总基因数的14.7%。3.以iTL885为平台运用COBRA模拟算法从溶氧、木糖转运和木糖代谢角度阐明了制约乙醇高效合成的限制因素。鲁棒性分析表明溶氧对乙醇生成影响很大,只有当溶氧在一定低水平（1.15mmol/gDCW/h）时乙醇生成速率能够达到最大水平（4.72mmol/gDCW/h）; FBA从核心代谢流量分布的角度定量证实限制溶氧可使乙醇合成相关途径关键基因（PDC、ALD、ADH）的流量提高约10倍；在具体阐述木糖转运和代谢途径的基础上,基于OptKnock提出可分别敲除GLY、ALA2、GDH3三组基因来提高乙醇的生成速率,并预测了20种常见氨基酸的添加对细胞生长和乙醇合成的影响,其中谷氨酸添加最有效,可使野生菌的乙醇生成速率提高27.7%。4.采用比较基因组学的方法对树干毕赤酵母的转录因子进行预测和鉴定,获得87个可信度较高的TFs和344个TFs备选转录因子库。通过与酿酒酵母同源转录因子的比对发现：葡萄糖浓度感应和氧气调节途径的相关蛋白在两株菌中表现出高度的序列保守性,而有关乙醇耐受性和糖酵解流量调节的基因只存在于酿酒酵母中,较高的乙醇耐受性和糖酵解流量是酿酒酵母为适应高糖浓度发酵进化出来的机制。与酿酒酵母中葡萄糖诱导发酵不同,在树干毕赤酵母中只有限制氧气的供给才会诱导发酵生成乙醇。
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