褪黑素作为一种广泛存在于机体各组织器官的内源性激素,对动物生殖发挥重要调节功能。但是,褪黑素对于卵泡发生,尤其是卵泡发生早期阶段的影响及其作用机制尚不清晰。猪是医学试验的理想动物模型,开展猪的腔前卵泡研究,不仅可弥补小鼠等模式动物的不足,为人类腔前卵泡的体外培养提供方法与技术支持,还可以为深入揭示人类卵泡发育的分子机制提供素材与研究参考。鉴于体内卵泡发生的复杂性,本研究通过建立猪腔前卵泡体外贴壁培养体系,并添加褪黑素处理,旨在探明褪黑素单因素对卵泡发生的影响及其作用机制。通过比较青年母猪卵巢形态学指标,明确了选择表面光滑,无红/黄体存在,小腔卵泡密集分布卵巢组织的标准。通过对卵泡直径与卵母细胞直径以及卵泡囊腔形成的精确测定,发现直径小于300 μm猪卵泡极少有囊腔形成,且卵母细胞直径均小于90μm。利用有血清贴壁培养方式培养猪卵母细胞-颗粒细胞复合物（PFs-OGCs）18.5 d后对其进行成熟培养（IVM）,我们成功获得了猪腔前卵泡来源成熟卵母细胞,并经过孤雌激活获得了孤雌激活囊胚,成功建立了猪腔前卵泡有血清体外贴壁培养体系。通过比较不同褪黑素添加浓度对猪PFs-OGCs回收率、成熟率、孤雌激活卵裂率以及囊胚率的差异发现,10^-5M褪黑素能够有效提高体外培养猪PFs-OGCs孤雌激活囊胚率。通过将褪黑素与其通用型受体抑制剂Luzindole共同处理PFs-OGCs,发现Luzindole能够有效抵消褪黑素对体外培养猪PFs-OGCs成腔率、孤雌激活卵裂率以及囊胚率的促进作用。通过检测活性氧（ROS）水平与抗过氧化物酶相关基因mRNA表达,发现褪黑素对体外培养4.5 d PFs-OGCs ROS水平无显著影响,但是Luzindole能够有效中和褪黑素对其Gpx4 mRNA表达水平上调的影响。同时,为探索褪黑素影响猪卵泡发生的分子机制,对褪黑素（10-5M）处理18.5 d的PFs-OGCs进行转录组测序（RNA-Seq）,利用差异基因表达分析,共筛选出了 71个上调基因和1个下调基因。qPCR验证结果与测序结果一致,说明RNA-Seq数据真实可靠。通过Gene Ontology显著性富集分析,发现涉及到的差异表达基因更多的是参与生物过程,而数量较少的是分子功能。KEGG Pathway分析结果表明,褪黑素主要是引起代谢通路上基因的变化发挥调控作用,同时也参与了卵母细胞减数分裂等通路的调控。鉴于鞘膜细胞是卵泡细胞的重要成员之一,我们同时研究了褪黑素对鞘膜细胞的影响。利用机械-酶解法分离出猪卵巢鞘膜细胞,并通过细胞密度梯度离心法对其进行纯化。获得了波形蛋白（间质marker）阳性率为93.8%;细胞角蛋白（上皮细胞marker）阳性率为6.7%;因子Ⅷ（内皮细胞marker）阳性率为0.7%的高纯度鞘膜细胞。通过RT-PCR与免疫组化检测,发现鞘膜细胞上存在褪黑素受体MT2表达。利用MTT法检测不同浓度(10^-3M～10^-9M)褪黑素处理48h对鞘膜细胞细胞活力的影响发现,10^-5～10^-9M褪黑素能够提高鞘膜细胞活力,但差异不显著。利用放免法分析褪黑素(10^-5M,10^-7M,10^-9M)处理48h对鞘膜细胞类固醇激素分泌水平的影响发现,褪黑素对鞘膜细胞雄烯二酮的生产存在剂量依赖性抑制作用。但是对孕酮分泌无显著影响。q-PCR结果表明,褪黑素(10^-5 M)显著抑制类固醇生成酶相关基因表达,而Luzindole仅能缓解褪黑素对Hsd3βmRNA的下调影响,不能解除褪黑素对雄烯二酮的抑制作用。同时,褪黑素处理显著提高鞘膜细胞Gpx4 mRNA表达水平,但是对ROS水平无显著影响。综上,本研究成功建立了能够支持稳定获得孤雌激活囊胚的猪PFs-OGCs有血清体外贴壁培养体系,并利用该体系初步探明了褪黑素通过受体介导与增强细胞抗氧化能力促进PFs-OGCs体外生长与发育的功能机制。利用RNA-Seq技术发现褪黑素可能通过影响PFs-OGCs代谢通路发挥功能。发现猪卵巢鞘膜细胞上有褪黑素受体2（MT2）.表达。褪黑素对鞘膜细胞雄烯二酮分泌存在剂量依赖性抑制作用,且抑制类固醇生成酶相关基因表达与增强细胞抗氧化能力是褪黑素影响猪鞘膜细胞的功能机制之一。但是,褪黑素对鞘膜细胞雄烯二酮的剂量依赖性抑制作用的主要功能机制尚不清晰,需要进一步深入研究。