花是被子植物特有的创新性状,其出现和多态性极大地提高了被子植物的繁殖效率和环境适应性。被子植物花的多样性一直以来被认为与传粉者选择密切相关。为了适应不同的传粉者,花在形态、大小、结构、颜色、器官的组成和排列方式等方面都呈现出丰富的多样性。其中花色作为被子植物花器官的重要表型性状,在吸引传粉者方面有着非常重要的作用。大部分被子植物(除石竹目)花色的形成主要由类黄酮类物质花色苷决定。花色苷是一类由花青素苷元和糖类通过糖苷键结合后的水溶性化合物,因在结构上具有不同的修饰基团可以形成不同的花色苷,从而导致花器官显现出不同的颜色。花色苷的合成通路在被子植物中非常保守,其调控机制也比较明确。因此,可以通过研究近缘物种之间花色差异的分子机制,探讨花色转换的遗传学基础,从而为近缘物种之间性状演化的机制提供证据。课题组前期研究发现紫花升麻与小升麻是亲缘关系较近的姊妹物种,但二者花色差异明显,并伴随着传粉者的转换:前者花萼为紫色,主要传粉者为黑盾胡蜂;后者及属内其他物种花萼为白色,主要传粉者为蝇类。此外,二者在遗传上已经明显分化。因此,紫花升麻与小升麻的分化及物种形成可能是由传粉者介导的。这就为研究传粉者介导物种形成的分子机制,或者更广泛意义上适应的分子机制,提供了良好的研究材料。本研究首先利用植物化学的方法鉴定了紫花升麻与小升麻花萼中所含花色苷的成分和含量;其次利用转录组测序的方法对二者花萼颜色不同的分子机制进行分析,找出目标基因;最后利用定量PCR方法对转录组结果进行验证。主要结果和结论如下:1、通过紫外-可见分光光度计和高效液相色谱法对紫花升麻与小升麻萼片中的花色苷类型和类黄酮类物质进行鉴定,在紫花升麻花蕾期萼片中未检测到花色苷,其槲皮素含量为2.56μg/g;盛花期萼片中含有的花色苷为矢菊-3-O-葡萄糖苷,含量为21.59μg/g,槲皮素含量为1.74μg/g。小升麻花蕾期及盛花期萼片中均未检测到花色苷,两个阶段中槲皮素的含量分别为5.79μg/g及2.81 μg/g。小升麻花蕾期萼片中槲皮素含量显著高于紫花升麻(p<0.01)。2、使用Illumina HiSeqTM2000平台对紫花升麻与小升麻叶片、花蕾期及盛花期萼片进行转录组测序。经过De novo组装共得到193058个Transcripts和1 10338个Unigenes,平均长度分别为1074 bp和1080 bp,N50分别为1550 bp及1619 bp。利用 Blastx 将 64184 个 Unigenes 注释到 Nr、Swissprot、TrEMBL、COG、KOG、Pfam、GO、KEGG,其中注释进KEGG数据库的基因数量为15458个。差异表达基因分析结果表明,在紫花升麻萼片中,合成花色苷的结构基因PAL、C4H、4CL、HCT、CHS、F3H、F3’H、DFR、ANS的表达量差异明显,表达的高峰期出现在花蕾期萼片中。而在小升麻的三个阶段中,花色苷合成通路上的基因并未出现差异性表达,其中直接参与调控矢车菊花色苷合成的CHI、DFR、ANS在叶片和盛花期萼片中表达量非常低,在花蕾期萼片中亦是轻微表达。此外,FLS及F3’H在小升麻花蕾期萼片中表达量非常高,表明这一阶段槲皮素大量合成,这与前面植物化学方法鉴定的结果一致。在转录因子分析中,总共筛选出309个R2R3MYB转录因子,其中有36个存在差异性表达;25个bHLH蛋白中只有2个差异表达;389个WD40蛋白有40个存在差异性表达。通过与其他参与花色形成的三类转录因子的序列比对、系统发育树构建、氨基酸序列结构和启动子分析,在紫花升麻中筛选到三个可能参与花色苷合成调控的转录因子,分别为ApMYB12、ApbHLH1和ApbHLH2。在筛选的结构基因中,除CHS外,均含有可以与以上三个转录因子互作的启动子序列。而在小升麻中,未筛选到可以与结构基因互作的转录因子。综合这些结果可以发现,紫花升麻萼片中矢车菊花色苷合成通路正常调控和表达;而小升麻萼片花色苷合成通路中大部分结构基因表达量较低,其原因可能为上游转录因子表达量低。此外,小升麻萼片中槲皮素含量较高也可能是其呈现白色的原因之一。本研究对紫花升麻与小升麻花色差异的物质基础和分子机制进行了研究,发现造成二者花色差异的原因是调控矢车菊花色苷合成通路的转录因子的不同表达。这些结果表明,转录因子在适应和物种形成中具有非常重要的作用。同时,本研究为进一步在紫花升麻和小升麻这一体系中探究传粉者介导的物种形成分子的机制奠定了基础。