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持留菌对抗菌药物产生耐受性，属于表型变异，是临床慢性感染以及感染复发的重要原因；同时，其可促进耐药菌的产生，增加治疗难度。金黄色葡萄球菌持留菌形成机制尚未明确，有待进一步探讨。由于持留菌的形成与代谢密切相关，本课题采用代谢组学以及转录组学和代谢组学联合分析的方法探讨金黄色葡萄球菌持留菌形成的机制。
目的：
1.从转录和代谢层面探究金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌形成的机制。
2.探究氨基酸代谢通路在金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌形成和维持持留状态中的作用。
方法：
1.将金黄色葡萄球菌Newman株1:1000稀释接种后培养3、4、5、6、9和24小时，通过氨苄青霉素(20μg/mL)和诺氟沙星(20μg/mL)暴露试验测定不同时间点的持留菌形成水平。
2.收集3、4和5小时的细菌，进行非靶向代谢组学检测和生物信息学分析(包括PCA、PLS-DA、OPLS-DA、单变量统计分析、差异性代谢物聚类分析和差异性代谢物富集分析)，并结合前期已有的转录组学结果进行转录代谢联合分析，筛选与金黄色葡萄球菌持留菌形成可能相关的通路。
3.对代谢组学筛选出的精氨酸代谢通路、谷氨酸和天冬氨酸代谢通路上的关键基因的表达水平进行qPCR检测。
4.基于同源重组原理，选用pMX10质粒敲除金黄色葡萄球菌gltB并进行测序验证获得ΔgltB菌株，对比测定ΔgltB和野生株在培养3、4、5、6、9和24小时时间点持留菌的形成水平；通过TSA平板和血平板上培养物的观察以及血浆凝固酶试验，测定gltB敲除对金黄色葡萄球菌生长、血平板溶血以及凝固酶产生的影响。
结果：
1随着培养时间延长，金黄色葡萄球菌形成持留菌的能力增强；3小时和4小时的培养物对抗生素的敏感性高，在高浓度氨苄青霉素和诺氟沙星处理后约2-3天死亡，从5小时开始，培养物中持留菌显著增加，且始终维持在高水平的状态，5、6、9和24小时的菌液在药物作用10天后仍有大量活菌存在。
2代谢组学结果显示，培养4小时的细菌与3小时的细菌相比，共有42种差异性代谢物，其中39种升高，3种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢和信息传递过程等通路；培养5小时的细菌与3小时的细菌相比，共有48种差异性代谢物，其中45种升高，3种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢、信息传递过程、维生素辅因子代谢、脂质代谢和次级代谢产物代谢等通路；培养5小时的细菌与4小时的细菌相比，共有59种差异性代谢物，其中49种升高，10种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢、信息传递过程、维生素辅因子代谢、脂质代谢、碳代谢和次级代谢产物代谢等通路。整体呈现：随培养时间延长，代谢物累积，提示代谢水平不活跃。
3.转录组学与代谢组学联合分析发现，碳代谢通路(主要包括丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸循环等)、氨基酸代谢通路(主要涉及氨基酸合成代谢)、维生素和辅因子代谢通路(主要涉及烟酸盐和烟酰胺代谢)、甘油磷脂代谢通路和核苷酸代谢通路与金黄色葡萄球菌持留菌的形成密切相关。
4.对精氨酸代谢通路、谷氨酸和天冬氨酸代谢通路的qPCR验证发现，gudB、gltB、gltD、NWMN_2454、glnA和NWMN_2065的表达水平在5小时时间点显著高于3小时和4小时时间点(p<0.05)；NWMN_0126、argG、argH，argF、arcB、arcA、argJ、argC、purB、purA、pyrB在3小时时间点显著低于4和5小时表达持续降低(p<0.05)。
5.测序分析证实，金黄色葡萄球菌gltB敲除成功。进一步开展的氨苄青霉素和诺氟沙星暴露试验证实，金黄色葡萄球菌ΔgltB与野生株在3小时、4小时，5小时和6小时形成持留菌的水平无明显差别；在9小时、24小时时持留菌的持留状态维持能力较野生株明显减弱。
6.与野生株相比，ΔgltB菌落呈灰白色，凝固酶试验阴性，但在血平板上培养12小时开始出现溶血现象，早于野生株。
结论：
1.金黄色葡萄球菌培养至某一特定相时，可出现持留菌数目和持留程度的质变。代谢水平调整在金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌的形成中发挥重要作用。其中碳代谢通路(主要包括丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸循环等)、氨基酸代谢通路(主要涉及氨基酸合成代谢)、维生素和辅因子代谢通路(主要涉及烟酸盐和烟酰胺代谢)、甘油磷脂代谢通路和核苷酸代谢通路与金黄色葡萄球菌持留菌的形成密切相关。
2.精氨酸代谢通路与谷氨酸和天冬氨酸代谢通路参与金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌的形成；gltB在调控金黄色葡萄球菌维持持留状态中发挥重要作用。gltB可影响金黄色葡萄球菌色素和凝固酶的合成以及血平板的溶血能力。
目的：
1.从转录和代谢层面探究金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌形成的机制。
2.探究氨基酸代谢通路在金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌形成和维持持留状态中的作用。
方法：
1.将金黄色葡萄球菌Newman株1:1000稀释接种后培养3、4、5、6、9和24小时，通过氨苄青霉素(20μg/mL)和诺氟沙星(20μg/mL)暴露试验测定不同时间点的持留菌形成水平。
2.收集3、4和5小时的细菌，进行非靶向代谢组学检测和生物信息学分析(包括PCA、PLS-DA、OPLS-DA、单变量统计分析、差异性代谢物聚类分析和差异性代谢物富集分析)，并结合前期已有的转录组学结果进行转录代谢联合分析，筛选与金黄色葡萄球菌持留菌形成可能相关的通路。
3.对代谢组学筛选出的精氨酸代谢通路、谷氨酸和天冬氨酸代谢通路上的关键基因的表达水平进行qPCR检测。
4.基于同源重组原理，选用pMX10质粒敲除金黄色葡萄球菌gltB并进行测序验证获得ΔgltB菌株，对比测定ΔgltB和野生株在培养3、4、5、6、9和24小时时间点持留菌的形成水平；通过TSA平板和血平板上培养物的观察以及血浆凝固酶试验，测定gltB敲除对金黄色葡萄球菌生长、血平板溶血以及凝固酶产生的影响。
结果：
1随着培养时间延长，金黄色葡萄球菌形成持留菌的能力增强；3小时和4小时的培养物对抗生素的敏感性高，在高浓度氨苄青霉素和诺氟沙星处理后约2-3天死亡，从5小时开始，培养物中持留菌显著增加，且始终维持在高水平的状态，5、6、9和24小时的菌液在药物作用10天后仍有大量活菌存在。
2代谢组学结果显示，培养4小时的细菌与3小时的细菌相比，共有42种差异性代谢物，其中39种升高，3种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢和信息传递过程等通路；培养5小时的细菌与3小时的细菌相比，共有48种差异性代谢物，其中45种升高，3种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢、信息传递过程、维生素辅因子代谢、脂质代谢和次级代谢产物代谢等通路；培养5小时的细菌与4小时的细菌相比，共有59种差异性代谢物，其中49种升高，10种降低，主要富集于膜转运、核苷酸代谢、氨基酸代谢、信息传递过程、维生素辅因子代谢、脂质代谢、碳代谢和次级代谢产物代谢等通路。整体呈现：随培养时间延长，代谢物累积，提示代谢水平不活跃。
3.转录组学与代谢组学联合分析发现，碳代谢通路(主要包括丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸循环等)、氨基酸代谢通路(主要涉及氨基酸合成代谢)、维生素和辅因子代谢通路(主要涉及烟酸盐和烟酰胺代谢)、甘油磷脂代谢通路和核苷酸代谢通路与金黄色葡萄球菌持留菌的形成密切相关。
4.对精氨酸代谢通路、谷氨酸和天冬氨酸代谢通路的qPCR验证发现，gudB、gltB、gltD、NWMN_2454、glnA和NWMN_2065的表达水平在5小时时间点显著高于3小时和4小时时间点(p<0.05)；NWMN_0126、argG、argH，argF、arcB、arcA、argJ、argC、purB、purA、pyrB在3小时时间点显著低于4和5小时表达持续降低(p<0.05)。
5.测序分析证实，金黄色葡萄球菌gltB敲除成功。进一步开展的氨苄青霉素和诺氟沙星暴露试验证实，金黄色葡萄球菌ΔgltB与野生株在3小时、4小时，5小时和6小时形成持留菌的水平无明显差别；在9小时、24小时时持留菌的持留状态维持能力较野生株明显减弱。
6.与野生株相比，ΔgltB菌落呈灰白色，凝固酶试验阴性，但在血平板上培养12小时开始出现溶血现象，早于野生株。
结论：
1.金黄色葡萄球菌培养至某一特定相时，可出现持留菌数目和持留程度的质变。代谢水平调整在金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌的形成中发挥重要作用。其中碳代谢通路(主要包括丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸循环等)、氨基酸代谢通路(主要涉及氨基酸合成代谢)、维生素和辅因子代谢通路(主要涉及烟酸盐和烟酰胺代谢)、甘油磷脂代谢通路和核苷酸代谢通路与金黄色葡萄球菌持留菌的形成密切相关。
2.精氨酸代谢通路与谷氨酸和天冬氨酸代谢通路参与金黄色葡萄球菌培养过程中持留菌的形成；gltB在调控金黄色葡萄球菌维持持留状态中发挥重要作用。gltB可影响金黄色葡萄球菌色素和凝固酶的合成以及血平板的溶血能力。