第一部分免疫性血小板减少症患者血浆中PGRN水平的检测研究背景:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是临床上比较常见的一种自身免疫性的出血性疾病。ITP的发生主要是由于患者对于自身的血小板抗原的免疫失耐受,产生了免疫介导的血小板过度破坏和/或生成的不足,最终导致血小板的减少。临床上的表现多以皮肤黏膜出血为主,严重的患者也可有内脏出血、颅内出血等,威胁患者的生命安全。关于ITP发病机制以及临床治疗的研究一直都是血液病领域内的研究热点之一。ITP的发病机制非常复杂,具体机制仍然不明确。众多研究证实,特异性抗血小板抗体介导的血小板过度破坏以及T细胞功能异常,例如Th1/Th2细胞比例的失衡、调节性T细胞数量的减少和功能的减弱以及功能强化的CD8+T淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞)等,在ITP发病过程中发挥着重要的作用。此外,越来越多的免疫调控分子也被证实参与了 ITP的病理生理过程。充分发掘参与ITP的调节分子及调控机制,对于改善ITP的治疗策略、提高ITP患者的治疗水平具有重要意义。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种自分泌的生长因子,它是由593个氨基酸所组成。PGRN在人体多种类型的细胞中表达广泛,比如造血细胞、免疫细胞、软骨细胞、T细胞等等。PGRN参与人体多种生理病理反应,有不同的生物学功能,与肿瘤、炎症、额颞叶痴呆等疾病有着密切的关系。近年来,PGRN在多种自身免疫性疾病中发挥的调节功能日益受到重视,例如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎等。在调控机制方面,PGRN主要通过与肿瘤坏死因子α(umor necrosis factor-α,TNFα)竞争性地结合肿瘤坏死因子受体(umor necrosis factor receptors,TNFRs),从而抑制了 TNFα所诱导的炎症反应。另外,PGRN能够在体外刺激调节性T细胞(regulatory t cells,Treg)的增殖,并减轻TNFα对其的抑制作用。如前文所示,Treg在ITP的发病中发挥着重要的作用,作为重要的免疫调节细胞,Treg抑制多种免疫细胞的活性,来维持自身的免疫耐受,预防诸如ITP之类的自身免疫性疾病的发生,而在ITP病人中Treg的数量减少、功能减弱,使得自身活化的B细胞或Th细胞逃脱了 Treg的监管,不断活化并产生自身抗血小板的抗体,并加强了单核巨噬系统对血小板的破坏,成为ITP发病的一个重要机制。因此我们推测,PGRN可能也参与ITP的发病过程之中。而作为一个重要的免疫调节分子,PGRN在ITP中的作用一直未得证实。在本研究中,我们对PGRN在ITP病理生理过程中的作用进行了初步探索。我们首先检测了 ITP患者、非免疫性血小板减少的患者以及正常人血浆中PGRN的表达水平。通过进一步的统计学分析,初步明确了 PGRN在ITP病理生理过程中的作用,为深入探索其调控机制奠定了基础。目的:PGRN是一种重要的免疫调节因子,并在多种自身免疫性疾病中发挥作用。ITP是临床常见的一种自身免疫性的出血性疾病,其发病机制复杂,且缺少敏感并独特的检测标志。本研究旨在明确PGRN是否在ITP发病过程中发挥调节作用,并进一步对其参与机制进行初步探讨,以期提高对ITP发病机制的认识。方法:1、选取52例ITP的患者(包括22名初诊患者及30名复发患者)、13例非免疫性血小板减少的患者及40例正常人志愿者的外周血,利用血细胞分析仪检测其血小板计数,并留血浆备用。2、利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)检测上述血浆标本中PGRN的水平。另外,利用该试验对19名ITP患者治疗后血浆中PGRN的水平进行了检测。3、利用Mann-Whitneytest,分别统计分析了 ITP患者与非免疫性血小板减少的患者及正常人血浆中PGRN水平的差异。同法,统计分析了 ITP初诊患者与复发患者血浆中PGRN水平的差异,以及非免疫性血小板减少患者的血浆中PGRN水平与正常人的差异。另外,利用Wilcoxon matched-pairs test,分别统计分析了 ITP初诊患者或复发患者治疗前后血浆中PGRN水平的差异。利用Spearman correlation analysis,统计分析了 ITP患者血浆中PGRN的表达水平与外周血血小板计数的相关性。p<0.05认为差异有统计学意义。结果:1、ITP初诊患者或复发患者血浆中PGRN水平均明显高于正常人及非免疫性血小板减少患者(初诊ITP患者43.79 ± 9.07 ng/mLvs.正常人20.51 ± 1.38 ng/mL,p<0.05;ITP 复发患者 42.04 ± 4.81 ng/mL vs.正常人 20.51 ±1.38 ng/mL,p<0.01;初诊 ITP 患者 43.79 ± 9.07 ng/mL vs.非免疫性血小板减少患者 19.24 ± 2.63 ng/mL,pp<0.05;ITP 复发患者 42.04 ± 4.81 ng/mLvs.非免疫性血小板减少患者19.24 ± 2.63 ng/mL,pp<0.05)。2、ITP初诊患者与复发患者相比,血浆中PGRN水平无明显差别(p>0.05);非免疫性血小板减少患者的血浆中PGRN水平与正常人也无明显差别(p>0.05)。3、经糖皮质激素治疗后,ITP初诊患者及复发患者血浆中PGRN的水平均发生显著下降(初诊患者治疗前后,66.48 ± 18.02 ng/mLvs.44.09 ± 14.45 ng/mL,pp<0.05;复发患者治疗前后,64.32 ± 7.262 ng/mL vs.43.28 ±7.797 ng/mL,,p<0.01)。4、ITP患者血浆中PGRN的表达水平与患者血小板计数呈负相关(= 0.011,r =-0.350)。结论:1、与正常人及非免疫性血小板减少的患者相比,ITP患者血浆中PGRN水平显著升高,提示PGRN可能参与调节ITP的疾病进程,并且PGRN有望成为鉴别免疫性及非免疫性血小板减少症的新型临床检测指标。2、经治疗后,ITP患者血浆中PGRN的水平显著下降,进一步提示了 PGRN在ITP中的潜在调节功能。3、ITP患者血浆中PGRN水平与其外周血中血小板计数呈负相关,同样提示了PGRN可能参与调控ITP的病理生理过程。第二部分PGRN在ITP动物模型中的作用及机制研究研究背景:ITP是一种以血小板减少为主要临床表现的自身免疫性疾病,目前诊断方法仍以排除性诊断为主。ITP的发病机制十分复杂,目前认为主要的发病机制是体液免疫和细胞免疫介导的血小板破坏增多,以及血小板生成不足。众多免疫调节因子在ITP的病理生理过程中发挥着作用。在前期研究中,通过对ITP、非免疫性血小板减少患者及正常人的外周血标本的检测及统计学分析,我们初步证实了具有免疫调节功能的PGRN很可能参与了 ITP发病机制的调控。接下来,我们将利用ITP动物模型(包括被动模型和主动模型),进一步明确PGRN在ITP中的作用,并初步探讨其作用机制。ITP动物模型对于研究ITP的发病以及治疗有着重要的作用,近年来有多种模拟ITP临床病理特征的动物模型被建立。早期有单纯利用射线照射或者注射有骨髓抑制作用的化学药物来导致血小板减少的动物模型,但是这些模型只能通过短暂的骨髓抑制作用来减少血小板的生成,并且可能产生化疗后骨髓损伤或者再生障碍性贫血等并发症,并不能很好的模拟ITP的致病过程。近年来被广泛接受并使用的有被动模型和主动模型两种。被动模型是通过人工免疫的方法来得到ITP模型,即向小鼠注射外源性的抗原或者抗体(例如外源性血小板、抗血小板血清、抗血小板单克隆抗体等),导致其血小板下降。这种动物模型的优势是操作相对简单,对于研究药物治疗效果的观察比较快速有效,缺点是持续时间较短,仅能模拟临床病理结果,并不能完全反应ITP复杂的致病机制。主动模型主要是由Chow等人发明改良的同时利用野生小鼠、CD61基因敲除鼠以及重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠,制造出能够产生自发免疫的ITP的动物模型,能够更好的反应出ITP的临床特征和模拟发病过程。ITP致病机制复杂,每种动物模型并不能十分完美的模拟出与人体一样的生理病理过程,但是动物模型的建立与研究对ITP的发病及治疗的探索都是十分有效与重要的,本研究建立了两种不同的ITP动物模型,并首次在造模过程中引入了 PGRN基因敲除鼠,探究了 PGRN在ITP中的作用以及可能的机制。目的:利用PGRN基因敲除鼠,构建两种ITP动物模型,并研究了 PGRN对ITP动物模型血小板计数的影响,以明确PGRN在ITP发病机制中的作用,探讨其作为ITP治疗药物的可能性。同时,以ITP动物模型为基础,初步探索PGRN参与调控ITP病理生理过程的潜在分子机制。方法:1、建立ITP被动小鼠模型。主要方法为:选取体重相近,6-8周的雌性C57BL/6J野生型小鼠(n = 6)以及PGRN基因敲除鼠(Grn-/-,n = 6),通过大隐静脉采血的方法,检测两组动物的外周血血小板的计数作为基础水平。为两组动物腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗体(5 μg/只),并在注射后3、24、48、72小时检测两组小鼠外周血血小板计数,利用Mann-Whitney test统计分析两组动物血小板计数在上述各时间点的差异。2、为Grn-/小鼠腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗体(5μg/只)以建立ITP被动小鼠模型,并小鼠随机分为两组。实验组(n = 5)腹腔注射加有50μg PGRN 的 100 μL磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS),对照组(n = 5)只给予相同体积的PBS溶液,并在注射CD41抗体后的3、24、48、72小时,分别检测两组小鼠外周血血小板计数,利用Mann-Whitney test统计分析两组动物血小板计数在上述各时间点的差异。3、选取6-8周并体重相近的C57BL/6J野生型小鼠(n = 6)以及Grn-/-小鼠(n =6),并为动物腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗体(5 μg/只)。在注射前或者注射24小时后分别取出各组动物脾脏,提取脾细胞。利用流式细胞术检测脾细胞中Treg细胞的比例,利用Mann-Whitney test统计分析两组动物间脾细胞中Treg细胞比例的差异。4、建立ITP主动小鼠模型。主要方法为:将野生C57BL/6J小鼠的血小板通过尾静脉注射的方法,注入CD61基因敲除小鼠体内,每次注射约108个血小板,连续四周。CD61基因敲除小鼠血浆抗血小板抗体滴度达标后,取CD61基因敲除鼠的脾脏,分离成单个细胞,取5×104个脾细胞经腹腔注射至提前接受全身200 cGy射线处理的SCID小鼠中,即建立了 ITP主动小鼠模型。在随机分组的两组ITP主动小鼠模型中(n = 8),每三天分别给予腹腔注射50μg的PGRN或者PBS,在第7、14、21、28天检测两组小鼠血小板的计数,并用Mann-Whitney test统计分析两组动物间血小板计数的差异。结果:1、利用C57BL/6J野生型小鼠及Grn-/-小鼠构建ITP被动模型,在腹腔注射大鼠抗小鼠CD41抗体后的3小时、24小时、48小时及72小时,PGRN敲除鼠外周血血小板计数的下降程度均显著高于野生型小鼠(3 h,p<0.05;24 h,p<0.01;48 h,p<0.05;72 h,p<0.01)。2、利用Grn-/-小鼠构建ITP被动模型,在对两组小鼠分别注射PGRN或PBS后24小时及48小时,注射PGRN组小鼠的外周血血小板计数均显著高于PBS组(P均小于0.05)。3、利用C57BL/6J野生型小鼠及Grn-/-小鼠构建ITP被动模型前,两组小鼠脾细胞中Treg比例无统计学差异(p>0.05);腹腔注射大鼠抗小鼠CD41抗体24小时后,Grn-/-小鼠脾细胞中Treg比例显著低于野生小鼠组(p<0.05)。4、ITP主动小鼠模型中,注射PGRN的小鼠组在第7、14、21天时血小板下降的程度显著低于仅注射PBS的对照组小鼠(7 d,p<0.05;14 d,p<0.01;21 d,p<0.05)。结论:在ITP被动模型及主动模型中,PGRN均具有促进血小板升高的作用,进一步证实了 PGRN在ITP中具有保护性调控作用。并且,通过对野生型小鼠及PGRN基因敲除鼠构建的ITP被动模型脾脏细胞中Treg比例的检测,发现了 PGRN基因的缺失会导致动物脾脏细胞中Treg比例的下降,这提示了 PGRN可能通过调控Treg细胞数目来参与ITP的病理生理过程。以上研究结果,证实了 PGRN在ITP发病机制中的调控作用,初步揭示了其调控机制,为今后更加深入的机制探索奠定了基础,也为ITP的治疗提供了新的候选药物及思路。