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第一部分：NR4A1在初诊2型糖尿病患者外周血单个核细胞中表达目的：探讨孤儿核受体NR4A1在2型糖尿病(Type2diabetes)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的表达变化及意义。方法：招募武汉大学中南医院就诊的34名健康受试者和30名初诊T2D患者,进行体格检查,包括身高、体重、血压,计算体重指数(body mass index, BMI);实验室检查：空腹血糖(fasting glucose, FBG)、空腹血胰岛素(fasting insulin, Fins)、总甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein, HDL-C)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP),计算HOMA-IR。采集外周血2-3ml,收集血浆,用于检测游离脂肪酸(free fatty acids, FFAs)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin,IL-6)；并采用密度梯度离心法获取PBMCs, real-time PCR检测NR4A1mRNA在健康人群和初诊T2D患者PBMCs中分布情况,并对NR4A1mRNA相对表达水平和HOMA-IR、FFAs、TNF-α、IL-6进行相关性分析。结果：两组人群在年龄、姓别、身高、血压、血谷丙转氨酶、血尿素氮、血肌酐方面,无统计学差异；与对照人群进行比较,初诊T2D患者的PBMCs的NR4A1mRNA相对表达水平增高,此外T2D患者的BMI、FBG、Fins、 HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、CRP、FFAs、TNF-α和IL-6水平亦明显增高,血HDL-C水平则降低；T2D患者的外周血白细胞计数及其分类计数与健康人群无统计学差异；Pearson’s相关分析显示,NR4A1mRNA相对表达水平与HOMA-IR (r=0.761, p<0.01)、FFAs (r=0.560, p<0.01), TNF-α (r=0.697, p<0.01) and IL-6(r=0.796, p<0.01),均呈正相关。同时,评价胰岛素抵抗程度的HOMA-IR也与FFAs (r=0.513, p<0.01), TNF-α (r=0.728, p<0.01)和IL-6(r=0.590, p<0.01)呈正相关。此外,显著正相关也存在于FFAs和TNF-α (r=0.475, p<0.01), IL-6(r=0.402,p<0.01)之间。结论：NR4A1在初诊T2D患者PBMCs中表达增高,且与HOMA-IR、FFAs、 TNF-α、和IL-6均呈正相关关系。第二部分：高糖、高脂对人PBMCs中NR4A1表达的影响目的：探讨高糖、高脂对人PBMCs孤儿核受体NR4A1表达的影响。方法：招募武汉大学中南医院就诊的健康人群,采集外周血,密度梯度离心法收集PBMCs,原代培养。分别予以含33.3mM葡萄糖或250μM棕榈酸(palmitic acid, PA)的培养基处理2小时,收集细胞上清,ELISA检测TNF-α、IL-6浓度,并收集细胞,提取总RNA和蛋白,实时荧光定量PCR、western-blot检测NR4A1表达水平。结果：健康人群来源的PBMCs,与正常葡萄糖浓度的培养基比较,经33.3mM葡萄糖刺激2小时后,细胞上清中TNF-α、IL-6水平分别是32.60±37.84pg/ml vs.31.48±4.71pg/ml, p>0.05.6.82±25.91pg/ml vs.4.93±1.53pg/ml, p>0.05;而经2小时250mM PA刺激后,PBMCs细胞上清中TNF-α、IL-6浓度分别是543.31±40.08pg/ml vs.26.09±9.35pg/ml, p<0.01,276.82±24.88pg/ml vs.7.80±3.45pg/ml, p<0.01。2小时33.3mM葡萄糖刺激对人PBMCs中NR4A1mRNA及蛋白表达均无显著影响,分别是1.23±0.17vs.1.00±0.07,p>0.05,0.57±0.12vs.0.51±0.09,p>0.05；而较对照组比较,2小时250mM PA处理在mRNA水平和蛋白水平均明显促进人PBMCs中NR4A1的表达,分别是15.92±1.75vs.1.00±0.09,p<0.01、2.18±0.12vs.0.87±0.18,p<0.01。结论：高脂刺激在促进人PBMCs分泌TNF-α、IL-6的同时,亦显著诱导NR4A1的表达,而短时间高糖处理对人PBMCs TNF-α、IL-6分泌和NR4A1表达无显著影响。第三部分：Nat1对3T3-L1脂肪细胞PI3K/Akt信号通路的影响目的：全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)结果显示,人N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase2, NAT2)与胰岛素抵抗密切相关。人NAT2即为鼠Nat1。本研究目的在于探讨Nat1对3T3-L1小鼠脂肪细胞PI3K/Akt信号通路的影响。方法：采取3T3-L1小鼠前脂肪细胞为研究主体,予以脂肪细胞分化试剂促其分化为成熟的脂肪细胞,在分化的不同时间点观察细胞形态变化,并收集细胞,提取总RNA,real-time PCR技术检测Nat1表达变化。待细胞分化为成熟的脂肪细胞,分别予以pCMV-DDK-Natl质粒和siRNA瞬时转染成熟的3T3-L1脂肪细胞,并分别设立pCMV-DDK质粒和scramble RNA作为对照。转染48小时后收集细胞,以western-blot技术检测胰岛素信号转导通路中的Akt、p-Akt、IRS1、p-IRS1表达情况。结果：分别与对照组比较,转染pCMV-DDK-Natl质粒和siRNA的3T3-L1成熟脂肪细胞,Akt和IRS1磷酸化程度无显著改变。结论：Nat1对PI3K/Akt信号通路无明显影响。第四部分：Nat1对3T3-L1前脂肪细胞分化的调控作用目的：探讨Nat1对3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化的调控作用。方法：采取3T3-L1小鼠前脂肪细胞为研究主体,以构建的慢病毒载体pLV-GFP-sh、pLV-GFP、pWPI-GFP-Nat1、pWPI-GFP分别转导入3T3-L1前脂肪细胞,下调或上调Nat1表达,随后予以脂肪细胞分化试剂进行分化。待3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,油红O染色定性定量分析脂肪细胞分化成熟程度,流式细胞仪检测3T3-L1前脂肪细胞分化效率。结果：与对照组比较,pLV-GFP-sh转染后3T3-L1细胞分化率较低,pWPI-GFP-Nat1转染的细胞分化成熟率略高。结论：Nat1能促进3T3-L1细胞分化为成熟的脂肪细胞,下调Nat1的表达使3T3-L1细胞分化受抑。