胚胎干(Embryonic stem, ES)细胞能在体外长期传代培养并保持高度未分化状态,而给予适宜培养条件后,可在体外分化为不同胚层源性的任何类型细胞。虽然其具有分化全能性,但要应用于再生医学,仅有细胞来源是不够的,如何调控细胞命运,特别是干细胞的分化命运,才是科学界亟待解决的重大课题1,12,20。人参是著名的补益中药,应用于中医临床已有两千多年的历史,具有广泛的药理作用和医疗用途。近年来,大量研究已证实人参皂苷Rg1是人参作用于中枢神经系统的主要活性成分之一,具有广泛的神经保护和神经营养作用,但其具体作用机制迄今未明’。Rg1有类似甾体激素的刚性甾体母核,且体外实验也发现其具有雌激素样和糖皮质激素样的活性。大量文献报道甾体激素,如雌激素,孕激素和糖皮质激素等,均具有显著的神经保护和促智作用,因此推测Rg1的神经保护和神经营养作用可能与甾体激素受体的激动相关。本论文采用原代培养大鼠皮层神经元和小鼠ES细胞体外分化神经元两个模型,深入探讨了人参皂苷Rg1在神经保护和神经分化两方面的活性和可能机制,为其在防治神经系统疾病中的进一步应用提供理论支持。Junctophilin (JP)蛋白家族,是一类存在于可兴奋细胞中的新型膜结合蛋白,在进化上高度保守，其分布具有组织特异性,JP-3和JP-4属于神经亚型,在大脑皮层、海马及小脑表达丰度很高。文献报道,JP-3,-4基因双敲除的小鼠呈现运动协调功能失常和记忆认知功能损伤,提示这两种蛋白与动物的运动和记忆功能密切相关,但其在动物胚胎发育过程中的表达变化及功能特征尚未见报道,且两个亚型在分布和功能上的具体差异也尚未探明。本研究第三部分采用小鼠ES细胞体外分化为神经细胞体系,模拟神经的发生发育过程,考察JP-3,-4蛋白在分化所得各类神经细胞中的的表达特征,及其在ES细胞体外分化为神经元过程中的作用,旨在揭示JP-3,-4在神经分化发育过程中的生命现象本质,并探寻新的促神经再生药物作用靶点。1.人参皂苷Rgl对Aβ25-35所致原代大鼠皮层神经元损伤的保护作用(该部分内容已发表于Neuropharmacology)p淀粉样肽((3-amyloid, Aβ)是在阿尔茨海默(Alzheimer’s disase, AD)患者脑中发现的一种多肽,具有明显的神经毒性,目前认为是导致患者神经元变性和丢失的重要原因。本部分实验采用Aβ毒性片断Aβ25-35损伤原代培养大鼠皮层神经元的毒性模型,探讨了人参皂苷Rg1对Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用和相关机制,并明确各甾体激素受体在其中所扮演的角色。结果发现Rg1能剂量依赖性地对抗Aβ的神经毒性,其中20μmol/L为其作用的最佳浓度。Rg1孵育可引起雌激素受体α(ERa)和糖皮质激素受体(GR)的核转位,但对雌激素受体p(ERp)和孕激素受体(PR)无作用,且其与ERα和GR结合的IC50分别为8.6μmol/L和12.8μmol/L,提示Rg1具有体外选择性激动ERa和GR的作用。siRNA实验进一步证实基因沉默原代神经元的ERa和GR,可阻断Rg1的神经保护作用,表明Rg1的保护作用是通过选择性活化ERa和GR实现的,明确了Rg1的具体作用靶点。Aβ可引起原代神经元中活性氧(ROS)和NO生成,线粒体膜电位和ERK磷酸化下降,NF-kB激活,过氧亚硝酸根产生,进而导致神经元蛋白酪氨酸硝基化损伤和细胞凋亡,上述损伤现象均可被Rg1逆转或减轻。除了抗氧化效应,Rg1的上述神经保护作用均通过激动ERa和GR,进而启动下游信号网络调控,而其抗氧化作用可能与自身的自由基清除能力相关。上述结果提示,经由ERa和GR活化的抗酪氨酸硝基化-线粒体凋亡通路是Rg1神经保护作用的重要机制之一2.人参皂苷Rgl诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞的研究近年来发现,某些小分子化合物能通过作用于特定靶点,调控细胞的增殖和分化,因此,新型小分子探针的发现将为细胞移植,体细胞重编程和干细胞分化研究带来新的活力和希望。除了上述显著的神经保护活性,Rg1还具有调节神经祖细胞增殖的作用22,23,但其是否能影响神经分化尚未探明。本部分实验中,我们考察了人参皂苷Rg1促小鼠ES细胞体外分化为神经细胞的作用,并对相关信号通路进行了初步探索。结果发现,10μmol/L Rg1共孵育能促小鼠ES细胞体外分化为神经样细胞,显著提高分化所得细胞中神经前体细胞和神经元的比例,并上调神经标志性蛋白的表达量。此外,免疫荧光和western blot的结果均证实ES细胞中糖皮质激素受体(GR)的表达呈持续上调趋势。GR拮抗剂RU486可有效抑制Rg1促神经分化的作用。同时,Rg1还能提高ERK和Akt的磷酸化水平,且此作用也可被RU486所拮抗。为验证ERK与Akt是否参与Rg1的促神经分化过程,进一步采用MEK抑制剂U0126和P13K抑制剂LY294002,结果显示两者均可有效抑制Rg1的促神经分化作用,且U0126也可一定程度抑制Akt的磷酸化水平。上述结果提示,人参皂苷Rg1具有促小鼠ES细胞体外分化为神经元的作用,此作用经由GR-MEK-ERK1/2-PI3K-Akt通路实现。3.小鼠ES细胞衍生神经元JP-3,-4的表达及功能特征研究本研究第三部分采用小鼠ES细胞体外分化为神经细胞体系,模拟神经的发生发育过程,考察JP-3,-4蛋白的表达特征,及其在ES细胞体外分化为神经元过程中的作用。实时定量PCR和western blot法检测分化各阶段JP-3,-4基因和蛋白表达情况,结果表明无论是基因层面还是蛋白层面,JP-3,-4均呈现先上升后下降的表达趋势,其中JP-3的一过性高峰出现在贴壁分化的第5天(d8+5),而JP-4的高峰则在d8+0,提示两者脉冲式的表达可能在ES细胞定向分化为神经细胞早期具有特定的生物学意义。进一步采用免疫细胞化学法和流式细胞术考察JP-3,-4的分布,结果显示在分化所得的细胞类型中包含神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,JP-3,-4虽在星型胶质细胞中有一定程度的表达,但绝大部分存在于神经元中。同时,也发现分化所得的神经元中存在胆碱能神经元、谷氨酸能神经元和GABA能神经元,JP-3,-4在这三类亚型神经元中的表达量也有所不同,在谷氨酸能神经元中表达最多,胆碱能神经元中其次,而GABA能神经元中最少。为考察分化所得神经元中的JP-3,-4是否具有其固有的维持细胞内钙稳态的功能,进一步对分化所得的神经元进行小干扰实验,利用活细胞工作站,动态观测与JP-3,-4密切相关的内质网钙离子释放过程。结果显示si-JP-3,-4后,兰尼碱受体增敏剂咖啡因诱发的钙离子诱导的钙离子释放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)过程虽存在,但明显受到抑制,而JP-3,-4双干扰后,CICR则被完全阻断,提示ES分化所得神经元中的JP-3,-4均具有其固有的维持胞内钙离子平衡的功能。另一方面,既然JP-3,-4在分化早期呈现一过性上调的表达趋势,且此表达高峰的时间窗基本出现在神经前体细胞期,提示JP-3,-4表达可能与ES细胞的神经分化相关。为验证这一假说,本实验进一步采用RNA小干扰(siRNA)技术,沉默ES细胞中JP-3,-4的表达,目的在于抑制JP-3,-4的脉冲式表达,结果发现si-JP-3,-4的神经元分化率及神经标志性蛋白表达量均显著低于阴形序列对照组,且JP-4基因沉默对神经分化的抑制作用强于JP-3,提示JP-3,-4在ES细胞体外分化为神经元过程中起到重要作用。结论：1.人参皂苷RgI具有抗Aβ25-35所致原代培养大鼠皮层神经元损伤的作用,该作用与选择性激动ERα和GR相关,其下游分子机制包括上调ERK磷酸化,抑制NF-kB激活,减少蛋白硝基化损伤和阻断线粒体凋亡通路等。2.人参皂苷Rg1具有诱导小鼠ES细胞体外分化为神经元的作用,具体作用机制与启动GR-MEK-ERK1/2-PI3K-Akt信号通路相关。3.小鼠ES细胞体外分化所得神经元表达功能性的JP-3,-4,其主要分布于谷氨酸能神经元中,其次为胆碱能神经元,再次为GAB A(?)神经元。在分化过程中,JP-3,-4呈现一过性的上调表达,此表达高峰与ES细胞的神经分化密切相关,且JP-4的作用更为重要。