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目的:本研究以结核分枝杆菌H37Rv HupB蛋白为研究对象,探讨HupB蛋白对T淋巴细胞分化的调控作用,也为HupB蛋白的进一步应用提供可靠的理论参考。方法:HupB蛋白生物信息学分析:采用Ex PASY Prot Param、Prot Scaleon Expasy、TMHMM Server v.2.0、SOPMA、Vaxijen v2.0等在线工具,分析HupB蛋白的理化性质、疏水性、跨膜区、二级结构与抗原性;利用MEGA X 10.1.7、STRING数据库等分析工具,构建蛋白HupB的系统进化树,并分析其蛋白质相互作用。HupB蛋白的表达、纯化、鉴定:基于结核分枝杆菌H37Rv HupB蛋白的基因序列,构建p GEX-6p-1-Rv2986c重组质粒;转化重组质粒到大肠杆菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,SDS-PAGE分析HupB蛋白在大肠杆菌中的表达情况;GST Agarose纯化重组蛋白HupB,SDS-PAGE测定蛋白相对分子量;Et Eraser TM HP去除蛋白中的内毒素;圆二色光谱分析重组蛋白的二级结构。结核分枝杆菌H37Rv HupB蛋白对T淋巴细胞分化的调节作用:从武汉市医疗救治中心筛选出11例肺结核患者,10例非结核肺部疾病患者,以及10例健康人作对照;HupB蛋白与受试者的外周血单核细胞(PBMC)共培养48h;ELISA法检测PBMC释放细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TGF-β1以及TNF-α)的水平。HupB蛋白特异性IL-6的结核病诊断价值分析:基于前期结核患者PBMC受HupB蛋白刺激后释放的细胞因子情况,筛选40例肺结核患者、27例非结核肺部疾病患者,以及45例健康人作对照,验证HupB蛋白刺激结核患者PBMC所释放IL-6的特异性,并优化实验条件;ROC曲线分析实验样本数据,评估HupB蛋白特异性细胞因子在结核病诊断上的特异性与敏感度;通过Youden’s index分析,确定诊断的Cut-off value,对实验样本进行阴/阳性判别,并比较结核病现有的实验室诊断方法,探讨其潜在的应用价值。结果:结核分枝杆菌HupB蛋白由214个氨基酸组成,属于稳定、亲水性蛋白,不含跨膜区,具有较高的抗原性;二级结构主要由α-螺旋(51.40%)构成;在进化关系上,Mycobacterium tuberculosis H37Rv菌株编码的蛋白与Mycobacterium canettii菌株编码的蛋白亲缘关系最为接近,属于同一进化分枝;蛋白质相互作用分析显示,HupB蛋白主要与Mih F、Phe T、Top A、Pol A与Dna A 5个蛋白发生相互作用,分布于细胞壁、细胞质与质膜,能与DNA结合,参与胞内大分子代谢、核酸代谢等生物过程。成功构建p GEX-6p-1-Rv2986c重组质粒,并获得重组蛋白HupB,蛋白浓度为853μg/m L,重组蛋白的分子量为51 k Da,与理论值相符;蛋白质内毒素含量低于0.3 EU/m L,可用于后续实验;25℃时重组蛋白HupB的二级结构包括13.4%α-螺旋,32.1%β-折叠,54.5%无规则卷曲。细胞因子测定结果显示,肺结核患者、非结核肺部疾病患者与健康人之间的PBMC受蛋白HupB刺激后释放的细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TGF-β1以及TNF-α无显著性差异(P>0.05);肺结核组经蛋白HupB刺激后,PBMC释放的IL-6的量为788.1±608.0 pg/m L,而未加蛋白HupB刺激时PBMC释放的IL-6的量为72.29±20.38 pg/m L,差异显著(P<0.0001);非结核肺部疾病组经蛋白HupB刺激后,PBMC释放的IL-6的量为259.3±99.81 pg/m L;健康组经蛋白HupB刺激后,PBMC释放的IL-6的量为53.51±9.019 pg/m L,与肺结核组均差异显著(P<0.0001)。以肺结核患者为实验组,非结核肺部疾病患者与健康人为对照组,ROC曲线分析显示,ROC曲线下与坐标轴围成的面积(AUC)值大于0.9,P值小于0.0001,有统计学意义。基于Youden’s index,得到Cut-off value,对实验样本进行判别,其诊断敏感性为88.89%,诊断特异性为86.57%,诊断准确率为87.5%。结论:1.IL-6是一种炎症因子,肺结核患者PBMC在HupB蛋白刺激后IL-6分泌量增加,表明IL-6可能参与到结核分枝杆菌(MTB)感染机体的进程,为进一步研究MTB的发病机理提供参考;2.HupB蛋白较高的抗原性,并与多种参与DNA结合、核酸代谢的蛋白质相互作用,联合HupB蛋白对肺结核患者PBMC的诱导结果,表明HupB蛋白具有诊断、免疫治疗与预防的潜在应用,有助于进一步探讨MTB与免疫系统相互作用的机制。3.HupB蛋白诱导肺结核患者PBMC所释放的IL-6高于非结核肺部疾病患者与健康人,对结核病的辅助诊断与治疗效果评估具有潜在的应用价值;4.HupB蛋白特异性白介素-6反应可作为肺结核病潜在的诊断方法,应用于临床研究。