白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积,并浸润其他非造血组织和器官,同时抑制正常造血功能。据报道,我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位,儿童白血病的发病率更是排在儿童恶性肿瘤的首位。尽管在过去几十年里,白血病的治疗取得了很大进展。但是由于白血病的复杂性和异质性,治疗白血病一直是具有挑战性的。这种复杂性部分是由于白血病及其微环境之间相互作用造成的。在过去十年中,骨髓微环境在白血病发生、发展及耐药方面的作用机制是血液恶性疾病研究的热门领域。骨髓微环境是由骨髓基质细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞及其产生的细胞外基质和细胞因子、骨桥蛋白、钙离子等组成的结构单位。细胞外基质和骨髓微环境内的可溶性细胞因子支持造血细胞的生长、增殖、分化,并通过分泌可溶性细胞因子、细胞黏附作用、上调耐药基因、调节白血病细胞的代谢及改变细胞周期等机制使白血病细胞能够逃避化疗药物的杀伤。目前大多数已发表的实验数据是基于二维细胞培养条件下,也就是常规的组织细胞培养,这些常规细胞培养,条件简单和体内环境不符,不能充分反映真实细胞生理情况。他们改变了细胞的特异性结构（极性,形态）,生化信号,细胞-细胞,细胞-基质间的信号传导。虽然二维培养有助于我们理解细胞生物学行为,但是现在已经证明二维培养系统导致细胞生物活性不同于体内。例如,一些重要的癌细胞特征（如基因图谱或肿瘤异质性）在二维培养条件下不能够正确的表现出来。动物模型是研究一个现象或机制另一种常用的方法,然而,在某些实验中许多实验动物已经被破坏了免疫系统,不能像人类一样提供基质与肿瘤之间的交互作用,阻碍了实验室研究成果到临床应用的有效转化。动物模型和临床试验结果一致几乎达不到8%。因此,从二维细胞培养转换到三维细胞培养是出于临床的需要,三维细胞培养能够更好地诠释肿瘤细胞生物学行为的复杂性。三维细胞培养平台通过保持肿瘤与基质细胞原有的形状、细胞极性、遗传性状来克服二维细胞培养的局限性。白血病目前仍是威胁人类生命安全的杀手,化疗治疗是治疗白血病的主要手段。但是化疗并不能治愈白血病（少数类型除外）,虽然骨髓细胞形态学、分子生物学、细胞遗传学、免疫学检查不断完善,白血病的预后得到很大改善。但白血病的复发和耐药,目前仍是国际难题。造血干细胞移植目前是唯一能治愈白血病的手段,但由于来源有限,价格昂贵,易复发,严重的移植物抗宿主病及技术限制,国内大部分白血病病人不能够进行造血干细胞移植治疗。且对于复发难治的白血病,造血干细胞移植的成功率也比较低,死亡率很高。近几年新药的不断问世使得难治性白血病预后得到明显改善,通过对白血病细胞的信号通路研究,找到白血病耐药及复发可能的发病机制并研发靶向药物,逆转白血病耐药,是血液病领域的研究热点。如伊马替尼,达沙替尼,博纳替尼明显改善了慢性粒细胞白血病的预后。利妥昔单抗的出现使得B细胞型非霍奇金淋巴瘤的疗效明显提升。蛋白酶体抑制剂硼替佐米明显延长了多发性骨髓瘤患者的生存时间,维甲酸和三氧化二砷的出现使急性早幼粒细胞白血病成为唯一通过药物可以治愈的白血病,来那度胺对于5q-MDS效果显著,索拉菲尼对于伴有FLT3突变的白血病有较好的效果。地西他滨的应用明显改善了MDS患者的预后和生存时间,Acalabrutinib治疗复发难治性套细胞淋巴瘤,总反应率达100%。在苯达莫司汀和利妥昔单抗中加入Polatuzumab vedotin可以显著改善弥漫型大B细胞淋巴瘤的治疗反应率、无进展生存率以及整体生存率。新药的不断出现提高了血液恶性疾病患者的生存质量,改善了患者的预后。三维细胞培养通过模拟骨髓微环境,较二维细胞培养更加真实的反映体内白血病细胞的真实状态,为靶向药物的研发提供了可靠的工具盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1,DDR1）,因其胞外区结构类似凝集素盘状结构而得名。多种胶原蛋白是其配体,胶原蛋白配体能够特异性结合DDR1并激活DDR1,进而启动下游的信号通路分子,发挥其生物学效应。正常的DDR1信号调控基本的生理过程（如乳腺发育、肾功能等）。研究发现异常的DDR1信号则涉及多种人类癌症,且广泛高表达于多种肿瘤,如乳腺癌、卵巢癌、脑癌、肺癌、白血病、垂体腺瘤、神经胶质瘤等,与肿瘤的增殖、分化、侵袭、耐药相关。但是急性淋巴细胞白血病细胞DDR1的表达情况目前研究较少。研究目的比较三维细胞培养与二维细胞培养对于急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖、分化、化疗药物敏感性及DDR1蛋白表达的影响,通过靶向拮抗剂DDR1-IN-1特异性阻断DDR1功能,分析Jurkat细胞对于化疗药物敏感性有无变化,并进一步分析可能的信号通路,进而对于临床靶向药物的研发提供一定的指导意义。研究方法1、不同浓度鼠尾胶原修饰支架,修饰完毕后用同样方法接种同等数量的Jurkat细胞于支架上,4h后测定培养液中细胞数,计算出不同浓度鼠尾胶原对于Jurkat细胞支架接种率的影响,并优选出接种率最高的支架用于后续试验。2、通过CCK-8法在不同时间点测定二维和三维细胞培养体系下的OD值,比较二维培养和三维培养对于Jurkat细胞增殖的影响。3、通过流式细胞检测技术,分析Jurkat细胞免疫表型在不同的培养体系（二维培养体系、鼠尾胶原修饰三维支架培养体系、未修饰的三维支架培养体系）中有无变化,用于证明三维细胞培养支架是否适合Jurkat细胞培养。4、利用扫描电镜观察Jurkat细胞在三维支架上的增殖情况及细胞形态的变化。5、应用免疫印迹法（Western Blot）测定Jurkat细胞DDR1,STAT3,p-STAT3蛋白在不同的培养体系（二维培养体系、鼠尾胶原修饰三维支架培养体系、未修饰的三维支架培养体系）蛋白表达情况。6、通过CCK-8法测定Jurkat细胞在不同培养体系（二维培养体系、鼠尾胶原修饰三维支架培养体系、未修饰的三维支架培养体系）对化疗药物的敏感性。7、加入DDR1拮抗剂DDR1-1N-1后,再次通过CCK-8法测定Jurkat细胞在不同培养体系（二维培养体系、鼠尾胶原修饰三维支架培养体系、未修饰的三维支架培养体系）对化疗药物的敏感性。结果1、不同浓度鼠尾胶原（0,10,20,40,80,160,320ug/ml）修饰支架后,通过测定培养液中的细胞数间接反应细胞接种效率,结果显示80ug/ml胶原蛋白修饰的细胞支架细胞种植效率最高。2、通过CCK-8法比较二维和三维培养对于细胞增殖的影响,结果显示起始阶段三维较二维培养系统,细胞增殖滞后。但随着时间的延长,特别是144h和168h后,三维培养细胞增殖明显优于二维培养,且鼠尾胶原修饰的三维支架较未修饰的三维支架显示出优越性,并且能够维持细胞增殖更长时间。3、三维细胞支架培养细胞168h后,通过流式细胞检测技术检测细胞的免疫表型,结果表明三维和二维培养的细胞免疫表型(CD2⁺CD3⁺CD4⁺dimdim CD8^-CD34^-CD45^+dim)比较无明显差异。4、二维培养条件下,Jurkat细胞呈散在悬浮生长,可见少量细胞聚集。通过扫描电镜观察Jurkat细胞在三维支架上呈聚集性生长,细胞之间相互粘附。随着培养时间的延长,细胞聚集成“球形”。5、通过Western Bolt方法检测发现,不同培养体系的DDR1、p-STAT3蛋白表达量存在差异。鼠尾胶原修饰的三维支架培养系统,DDR1和p-STAT3蛋白表达最高,二维细胞培养系统DDR1和p-STAT3蛋白表达最低,未修饰的三维支架培养体系DDR1和p-STAT3蛋白表达介于两者之间。STAT3蛋白表达无明显差异。6、Jurkat细胞在不同培养体系,对于化疗药物阿糖胞苷及柔红霉素表现出不同的敏感性。对于阿糖胞苷处理二维培养体系,在48h,144h和168h,Jurkat细胞增殖活性分别下降至89.58%±3.26%,62.86%±6.84%和53.36%±3.37%。阿糖胞苷处理鼠尾胶原修饰三维支架培养体系,Jurkat细胞增殖活性分别下降至103.98% ±5.3%,88.69%±2.19%,77.11%±3.47%;而阿糖胞苷处理未修饰的三维支架培养体系,细胞增殖活性下降至87.98%±3.74%,73.28%±5.5%and 63.65%±0.81。柔红霉素处理二维培养体系和鼠尾胶原修饰三维支架培养体系,在96h和168 h Jurkat细胞增殖活性分别下降至57.67%±8.02%,42%±4.58%和78%±5.57%,57.33%±5.03%。而对于柔红霉素+阿糖胞苷联合处理二维培养体系、未修饰的三维支架培养体系,鼠尾胶原修饰三维支架培养体系,在168h检测细胞增殖活性分别下降至24.67%±4.73%,24.67%±4.73%和46.33%±4.04%。7、加入DDR1拮抗剂DDR1-IN-1后,不同培养体系的Jurkat细胞对于阿糖胞苷和柔红霉素的化疗敏感性均明显增加。144h后Jurkat细胞基本完全清除。结论:1、不同浓度鼠尾胶原修饰的支架都能够增加Jurkat细胞在支架上的粘附,80ug/ml鼠尾胶原修饰的支架更有利于细胞的粘附和增殖。2、三维细胞培养支架更加真实的模拟骨髓微环境,细胞形态和增殖过程更加接近真实状态,三维细胞培养支架能够为细胞的生长提供足够的空间,更加有利于细胞的长期生存。3、鼠尾胶原修饰三维支架培养体系的DDR1和p-STAT3蛋白表达水平均不同程度增高,提示鼠尾胶原作为DDR1配体能够刺激DDR1的表达,进一步促进STAT3的磷酸化。4、三维细胞培养体系不改变细胞免疫表型,不会引起细胞免疫表型的变化。5、Jurkat细胞在不同的培养体系中,对化疗药物的敏感性不同。三维细胞培养条件较二维细胞培养条件下,细胞对化疗药物敏感性降低。6、加入DDR1拮抗剂DDR-IN-1,Jurkat细胞对化疗药物的敏感性增加,提示DDR1可能参与了Jurkat细胞的耐药机制。抑制或拮抗DDR1的功能可能提高Jurkat细胞对化疗药物的敏感性。