绵羊与海兰褐鸡Brachyury基因的克隆及原核表达

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:chinagirlxin
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Brachyury基因的主要功能是作为转录因子来调控胚胎的生长发育过程。Brachyury基因的突变会对小鼠胚胎中胚层和脊索的发育产生影响,最终导致脊椎动物出现短尾的症状,骨骼的发育也会发生异常。本文主要分为两部分,一部分是对三种绵羊Brachyury基因DNA序列进行研究;另一部分是对海兰褐鸡胚胎Brachyury基因的原核表达。  1.为了对绵羊Brachyury基因DNA序列进行研究,试验主要利用PCR的技术对乌珠穆沁羊、巴尔虎羊、呼伦贝尔短尾羊Brachyury基因序列进行扩增,首次获得了乌珠穆沁羊、巴尔虎羊、呼伦贝尔短尾羊Brachyury基因序列,并找出了三个品种绵羊Brachyury基因序列之间的差异碱基;将序列与GenBank数据库中登录的牛、人、大鼠、小鼠、山羊、猴和蝾螈等10个不同脊椎物种的Brachyury分子序列进行了比对分析。结果显示,绵羊Brachyury序列与牛Brachyury序列同源性最高,为96.30%;最低的则是来源于蝾螈的Brachyury序列,仅为58.45%。  2.为了表达Brachyury基因蛋白,本文根据GenBank中报道的原鸡Brachyury序列设计一对特异性引物,以海兰褐鸡胚胎尾芽组织提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,来扩增出海兰褐鸡胚胎Brachyury的cDNA,并克隆到PMD-19T载体中,经菌落PCR和DNA序列测定,证实所克隆的cDNA为海兰褐鸡胚胎Brachyury序列。将Brachyury的cDNA序列连接到表达载体PET32A上,将PET-Brachyury重组表达质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,经 IPTG诱导,高效融合表达了Brachyury蛋白。通过不断改变 IPTG的浓度和进行诱导的时间,确定了表达蛋白的最佳诱导条件。Western-blot分析表明:重组蛋白能与6*HIS标签抗体发生特异性反应。结果显示成功表达出海兰褐鸡胚胎Brachyury基因蛋白。
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