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海冰是极地海洋的一个重要部分,对极地海洋的生产力有十分重要的影响。Pseudoalteromonas sp. SM495是从北极海冰中分离得到的一株典型的适冷菌,E495是其胞外分泌量的最丰富的一种蛋白酶,该蛋白酶属于嗜热菌素家族。作为该家族的金属蛋白酶,我们首次发现,E495的PPC (Pre-peptide C-terminal domain)结构域在分泌到胞外的过程中没有被切除。分泌到胞外的E495存在三种不同的成熟形式,即不含PPC结构域、带有1个PPC结构域和带两个PPC结构域的三种成熟形式是同时存在的。我们将三种成熟态分别命名为E495-M-C1-C2C60kDa,含两个PPC结构域),E495-M-C1 (45kDa,含1个PPC结构域),E495-M(34kDa,催化结构域)。首先我们对E495的三种成熟形式进行了分离纯化,得到纯的E495-M和E495-M-C1,然后对E495-M和E495-M-C1进行了性质研究,发现E495-M和E495-M-C1对寡肽底物有类似的催化效率和底物亲和力,而与E495-M相比,E495-M-C1对别藻蓝蛋白(APC),藻蓝蛋白(CPC)和酪蛋白(a-casein)有着更高的催化效率和底物亲和力。这些结果表明E495-M-C1的C-端PPC结构域在催化蛋白底物降解中有一定的功能。于是,我们将PPC结构域与谷胱甘肽标签蛋白融合表达,进一步检测PPC结构域的功能。“pull-down"亲和层析和等离子共振解析(Surface Plasmon Resonance)实验都表明,PPC结构域能够吸附较大的底物蛋白分子如藻蓝蛋白或酪蛋白,这种蛋白与蛋白之间的结合,增大了底物与酶的亲和力。通过SPR测定的结合解离动力学常数显示,PPC1结构域比PPC2对CPC具有更高的结合能力。这些结果都显示,E495-M-C1中的PPC1结构域可以帮助酶蛋白结合蛋白底物,从而提高该酶的催化效率。为了进一步阐明PPC结构域的结合机制,我们对其关键位点进行了点突变。定点突变实验表明,PPC结构域中的D26,D28,Y30,W65是影响蛋白底物结合的关键位点。酪氨酸(Y)和色氨酸(W)都含有一个巨大的疏水的芳香环,说明疏水相互作用在维系PPC结构域与底物蛋白相互作用中扮演着重要的角色。而26位和28位天冬氨酸(D)可能通过形成盐桥来增强PPC结构域与底物的结合。这些研究结果表明E495的三种不同成熟形式可能是Pseudoalteromonas sp. SM495高效降解海冰中有机物质的一种生态适应,我们的研究可能有助于阐明北极海冰中有机氮的降解机制。