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第一部分早期糖尿病大鼠肠系膜及其血管的改变及小檗碱的干预作用糖尿病患者常伴有血管相关并发症的出现,而心血管并发症是造成患者死亡的主因。众多研究表明小檗碱具有抗炎、抗肿瘤、降糖等多种药理作用,对早期糖尿病大鼠进行小檗碱给药干预,观察小檗碱对血管的作用。目的:探究不同病程糖尿病大鼠肠系膜及其血管病变和小檗碱早期干预的作用,为小檗碱的应用提供实验依据。方法:将SD大鼠随机分成四组,分别为空白对照组(CON组)、糖尿病2周模型组(DM2W组)、糖尿病4周模型组(DM4W组)和小檗碱2周干预组(BBR组)。腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55 mg/kg)构建糖尿病大鼠模型。模型建成后,BBR组大鼠灌胃给予小檗碱(200 mg/kg)2周,每日一次,其他组动物灌胃给予等量生理盐水。比较各组间的体重和血糖变化。取大鼠肠系膜及其血管,制作铺片及石蜡切片,进行HE染色、免疫组化、Masson染色及荧光标记,观察各组肠系膜及其血管周围组织的病理变化。结果:1.体重和血糖变化:与CON组大鼠相比,DM2W组、DM4W组体重明显下降且差异有显著性(P<0.01),DM2W组和BBR组之间比较差异无显著性(P>0.05);与CON组大鼠相比,DM2W组、DM4W组和BBR组血糖显著升高且差异有显著性(P<0.01),DM2W组和BBR组之间比较差异无显著性(P>0.05);2.肠系膜血管及周围组织形态学变化:HE染色结果显示,CON组血管周围无炎性细胞浸润,DM2W组可见炎性细胞浸润,DM4W组有大量炎性细胞浸润,BBR组对炎性浸润有所改善,血管组织形态未见明显改变;3.肠系膜血管周围组织VEGF表达的变化:与CON组大鼠相比,DM2W组、DM4W组血管周围组织VEGF表达量显著增加(P<0.05,P<0.01),CON组与BBR组相比差异无显著性(P>0.05),DM2W组与BBR组相比差异有显著性(P<0.05);4.肠系膜血管周围脂肪的变化:与CON组大鼠相比,DM2W组脂肪细胞萎缩严重,细胞变小,分布较为零散,DM4W组较模型2周组细胞萎缩更加严重且明显减少,BBR组干预两周后脂肪细胞萎缩不慎明显,分布较为均匀;5.肠系膜胶原纤维的变化:CON组、DM2W组和BBR组肠系膜纤维横纵交错,分布密集,DM4W组肠系膜纤维量明显减少,分布较稀疏(P<0.01);6.一氧化氮(NO)的变化:DAF-2 DA染色结果显示,CON组大鼠肠系膜血管周围组织亮度明显,表明NO较多,DM2W组、DM4W组与CON组相比亮度下降,NO减少,DM4W组尤为明显,BBR组NO有所恢复;7.弹性纤维的变化:弹性纤维染色结果显示,CON组大鼠肠系膜弹性纤维分布均匀且密集,DM2W组与DM4W组的大鼠肠系膜弹性纤维分布减少,BBR组较DM2W组弹性纤维增多;8.酪氨酸羟化酶(TH)表达:TH荧光标记结果显示,CON组肠系膜血管脂肪周围有大量TH蛋白表达,DM2W组肠系膜血管脂肪周围TH蛋白表达量减少,DM4W组肠系膜血管脂肪周围几乎无TH蛋白表达,BBR组在药物干预后与CON组相近。结论:糖尿病2周大鼠肠系膜及其血管周围组织已发生明显病理改变;小檗碱干预后各种病理变化均有明显改善。第二部分小檗碱对血管内皮生长因子刺激血管平滑肌细胞的影响根据上部分的研究结果可知,血管周围组织血管内皮生长因子(VEGF)表达增多,VEGF表达量的变化可能使血管发生一系列病变,用VEGF刺激血管平滑肌细胞(VSMCs)并用小檗碱进行干预,观察VSMCs发生的变化反映对血管造成的影响。目的:探究BBR对VEGF刺激下的VSMCs变化的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法:在无菌环境情况下,取80 g左右SD雄性大鼠,麻醉后剖腹取其胸腹主动脉,使用组织贴块法培养VSMCs。待细胞生长汇合时,用0.25%胰酶消化传代,待细胞传至3~5代时用于实验。将细胞接种到细胞培养皿中,对细胞进行同化,再对细胞给予以下刺激:用不同浓度VEGF(0、10、20、50、100ng/m L)刺激细胞48 h,收集各组细胞爬片和细胞培养液;用浓度50 ng/m L VEGF刺激细胞不同时间(0、24、48、72 h)收集各组细胞爬片和细胞培养液;用10、50μMBBR孵育细胞24 h后,再用50 ng/m LVEGF刺激细胞48 h,同时设不加任何刺激的空白对照和只含有BBR或VEGF的对照,收集各组细胞和细胞培养液,观察VSMCs骨架、胶原蛋白分泌及细胞硬度的变化。结果:1.VSMCs骨架的变化:鬼笔环肽染色结果显示,10 ng/m LVEGF刺激VSMCs后与未刺激的VSMCs细胞微丝无显著差异,而后随着VEGF的浓度不断升高,可见VSMCs骨架微丝解聚现象明显加剧;随着VEGF的刺激时间不断延长,平滑肌细胞微丝解聚呈时间依赖型,刺激48 h、72h后,可见VSMCs骨架微丝解聚现象更加显著;空白对照组与10、50μM的BBR处理VSMCs后,细胞骨架微丝无明显差异,单独VEGF刺激VSMCs后,细胞骨架微丝明显发生解聚,BBR与VEGF共同刺激后,与VEGF单独刺激相比,VSMCs骨架微丝的解聚现象有明显改善,50μM的BBR改善作用较为显著;2.VSMCs胶原蛋白分泌的变化:各组的羟脯氨酸(HYP)含量测定结果显示,VSMCs经不同浓度VEGF刺激24 h后,分泌到细胞培养液中胶原蛋白的含量均有所增加,但差异无显著性,VSMCs在不同浓度VEGF刺激48 h后,各组胶原含量均有所增加,且50ng/m L和100 ng/m L浓度组显著性增加(P<0.05);空白对照与10、50μMBBR处理组相比,VSMCs胶原蛋白分泌量无明显变化,在单独VEGF刺激下,胶原蛋白分泌量明显升高(P<0.05),10、50μMBBR与VEGF共同刺激组与单独VEGF刺激相比,VSMCs胶原蛋白分泌量有所下降,50μMBBR处理组胶原蛋白分泌量显著下降(P<0.01);3.原子力显微镜测量VSMCs硬度的变化:原子力显微镜测量结果显示,在加入50ng/m LVEGF刺激后,VSMCs硬度明显增加(P<0.05),在10、50μMBBR与VEGF的共同刺激下,VSMCs的硬度均有明显的下降(P<0.01)。结论:VEGF刺激VSMCs发生细胞骨架改变,胶原蛋白分泌量增加且细胞硬度增强;BBR干预对VEGF刺激后的VSMCs骨架、胶原蛋白分泌量和细胞硬度的改变均有明显改善作用。