miRNA(microRNA)是由高等真核生物基因组编码产生的一种小的单链RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而在转录后水平调控蛋白质表达。miRNA的分布十分广泛，在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中起着重要的调控作用。游离miRNA是目前研究的热点。已有大量证据表明游离miRNA在细胞外以十分稳定的状态存在，同时，由于miRNA具有在物种间序列保守性、组织特异性及时序特异性表达等特点，显示出游离miRNA具有作为疾病标志物的潜能。　　 女性生殖过程是一个动态的受到高度调控的过程，已知有多种激素参与妊娠过程的调控，但更为精细的分子调控机制仍然是人们探索的热点。目前有研究证实多种miRNA参与女性生殖过程的调控。同时也有研究证实在妊娠期妇女的外周血中可检测到胎盘来源的miRNA，研究孕妇外周血中miRNA表达情况为探索妊娠调控机制提供了基础，为开展妊娠疾病的无创诊断展示了广泛应用前景。　　 当前技术日趋成熟的高通量测序技术为我们提供了一个在基因组水平检测miRNA表达谱的方案。本论文利用SOLiD测序平台，一方面，对正常妊娠期妇女的血浆miRNA表达谱进行检测，然后利用生物信息学对正常孕妇血浆中高丰度表达的miRNA进行了初步功能分析，以期了解血浆miRNA在妊娠调控中的潜在作用。另一方面，考虑到游离miRNA作为疾病标志物的潜力，选择妊娠期常见疾病—子痫前期，筛选差异表达的血浆miRNA，并对部分差异表达的血浆miRNA进行了验证，为深入研究子痫前期发病机制，筛选诊断标志物提供依据。论文主要研究内容及结果如下:　　 1.血浆样本小RNA提取及文库制备方法研究　　 外周血中miRNA含量较组织和细胞中少，而要利用高通量测序检测其miRNA表达谱，对样本小RNA提取要求很高。目前并无标准的适用于高通量测序平台的游离miRNA提取方法。根据SOLiD测序平台对测序样本的要求，我们对样本小RNA提取和文库制备方法进行了研究。　　 我们比较了三种小RNA提取方法:Trizol-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法、miRVanaIsolationKit方法。通过比较提取小RNA的总量，并对三种方法提取的小RNA样本分别定量检测miR-141水平，结果表明miRVanaIsolationKit法用于提取血浆小RNA的效果最好。然后，我们又对样本文库制备方法进行了研究。标准的接头连接过程中常出现接头自连接现象，接头自连接比例过高会影响SOLiD测序平台的有效测序通量。通过对标准接头连接方案和改进的单链接头连接方案制备的文库进行比较，乳液PCR扩增产物电泳结果及测序结果均提示单链接头连接方案可以有效降低接头自连接比例，提高文库质量。　　 2.正常孕妇血浆miRNA表达谱检测及初步功能分析　　 妊娠过程是一个复杂的动态变化的过程，miRNA可能参与了妊娠生理过程的调控。我们拟利用SOLiD测序平台检测不同孕龄孕妇血浆中miRNA的表达状况。在本研究中，收集不同孕龄正常孕妇的血浆样本共30例:早期妊娠(妊娠10-13周)、中期妊娠(妊娠24-28周)、晚期妊娠(妊娠37-40周，临产前)各10例。同时收集与之年龄相匹配的非妊娠妇女10例作为对照。对其血浆样本提取小RNA后进行SOLiD测序。　　 从妊娠期妇女血浆中共检测到了147种miRNA。对数据进行聚类分析，结果表明不同妊娠时期孕妇血浆中特定miRNA的表达水平是不同的。通过对孕妇血浆miRNA表达谱的观察，发现有三组miRNA簇在正常孕妇血浆中可以检测到，分别是miR-200c基因簇、miR-200b基因簇和miR-222基因簇。各miRNA簇中的成员在不同妊娠时期表达变化的趋势是一致的，这一现象提示miRNA簇的成员有可能是协同表达的。此外，在结果中还发现广泛存在的isomiR现象。我们选择了孕妇血浆中高丰度表达的miRNA进行了靶基因分析及功能富集。最终结果表明免疫疾病、细胞信号通路、肿瘤、细胞周期、胰岛素信号通路是这些孕妇血浆中高丰度miRNA参与调控的通路，而这些通路所反映的生理病理过程是和妊娠过程密切相关的。这一结果提示孕妇血浆miRNA很可能参与了妊娠过程的调控及母儿相互作用。　　 3.子痫前期患者血浆相关miRNA的筛选及验证　　 游离miRNA作为潜在的疾病标志物受人关注。子痫前期是严重危害母婴健康的妊娠期特有的疾病，其病因及发病机制至今尚未阐明，缺乏有效的治疗手段。已有研究通过研究胎盘中miRNA表达情况，认为特定miRNA可能参与子痫前期的发病过程，某些miRNA可以用作子痫前期标志物。但关于子痫前期患者外周血miRNA表达情况的研究很少，因此我们拟利用SOLiD测序平台筛选子痫前期患者血浆中miRNA差异表达情况，然后对差异表达的miRNA进行验证。　　 利用SOLiD平台对分别检测了1例轻度子痫前期、1例重度子痫前期和1例正常孕妇的血浆miRNA表达谱。比较差异表达的miRNA。以Foldchange＞2或＜0.5为标准我们在轻度子痫前期和重度子痫前期患者的血浆中共发现51种miRNA表达失调，重度子痫前期患者中22种表达上调，5种表达下调;轻度子痫前期患者中33种表达上调，6种表达下调。　　 此后，我们采用RT-PCR法对4种表达失调的miRNA(miR-141，miR-144，miR-221，miR-29a)在子痫前期及正常孕妇中进行了验证。与测序结果比较，miR-221和miR-29a在子痫前期患者血浆中表达变化的情况与测序结果相吻合，miR-141在重度子痫前期，miR-144在轻度子痫前期患者血浆中的表达变化与测序结果吻合。经统计学分析，miR-141在子痫前期患者血浆中表达水平升高，差异有显著性(P＜0.05)，miR-144在子痫前期患者血浆中表达水平下降，差异有显著性(P＜0.05)。进一步的分析显示miR-141表达水平与疾病病情相关(P＜0.05)。由于子痫前期是产科较为严重的疾病，缺乏有效的早期预测与诊断方法，为了解血浆miRNA在子痫前期诊断中的价值，进行ROC曲线(Rceiveroperativecharacteristic，ROC)分析显示血浆miR-144表达水平对于诊断子痫前期有价值(曲线下面积0.948)。以上结果初步验证了孕妇血浆miRNA水平与子痫前期发病的相关性，为进一步筛选子痫前期早期预测标志物提供了依据。