论文部分内容阅读
有报道称文殊兰具有抗肿瘤的作用,但其抗肿瘤的成分和机制尚不明确。本课题就文殊兰生物碱有效部位群:文殊兰强碱性生物碱(WSLQJ)的抗肿瘤活性进行了研究,并探讨了抗肿瘤作用的机制和途径,共分为文殊兰强碱性生物碱的提取和分离、对文殊兰强碱性生物碱敏感的受试肿瘤细胞株的筛选、文殊兰强碱性生物碱诱导MCF-7凋亡的研究、文殊兰强碱性生物碱诱导MCF-7凋亡机制的研究四个部分进行。文殊兰总生物碱的提取方法采用浸渍法与热回流提取法相结合,提取条件参考本课题组化学组的参考工艺:提取时间为3h,乙醇体积分数为85%,提取温度为65℃。文殊兰强碱性生物碱的分离采用溶剂法:通过逐量调节提取液的pH(9-10),萃取得到文殊兰强碱性生物碱。定性试验表明:文殊兰强碱性生物碱粉末的水溶性良好,用1640培养液溶解文殊兰强碱性生物碱使其终浓度为100μg/mL,以此浓度作为母液浓度,其pH值为7.38,适合细胞体外培养的pH环境,能够用于体外细胞实验。MTT实验表明:文殊兰强碱性生物碱对于人胃癌SGC-7901、肝癌HepG-2、乳腺癌MCF-7、肝癌SMMC-7721 四种细胞有明显抑制作用,并呈正相关剂量依赖性。底物浓度为 5×104 个/mL,给药浓度分别为 0.5μg·mL-1、1μg·mL-1、2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、16μg·mL-1、32μg·mL-1、64μg·mL-1。计算得出半数致死量(IC50)依次为16.555μg·mL-1、16.373μg·mL-1、6.219μg·mL-1、25.842μg·mL-1。筛选结果显示,由于文殊强碱性生物碱对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果尤为突出,因此选取乳腺癌MCF-7细胞作为受试肿瘤细胞株。用荧光倒置显微镜观察(目镜1Ox,物镜40x)WSLQJ对MCF-7细胞形态影响的实验表明:在文殊兰 强碱性生物碱作用下,给药浓度迂分别为3μg·mL-1、6μg·mL-1、12μg·mL-1,随着给药浓度的增加,细胞总数减少,凋亡细胞数量增加,凋亡细胞特征性形态更加明显。采用PI单染,在流式细胞仪下检测细胞凋亡率实验表明:细胞的凋亡率随给药浓度的增加而升高,呈正相关剂量依赖性。给药浓度分别为3μg·mL-1、6μg·mL-1、12μg·mL-1。研究结果显示,文殊兰强碱性生物碱能抑制MCF-7胞的生长并诱导MCF-7细胞凋亡。为下一步研究文殊兰强碱性生物碱的抗肿瘤机制奠定了基础。使用caspase-3 试剂盒对文殊兰强碱性生物碱作用下细胞中caspase-3活性检测的结果表明:文殊兰强碱性生物碱能提高胞浆caspase-3活性,给药浓度分别为3μg·mL-1、6μg·mL-1、12μg·mL-1,并且caspase-3活性与文殊兰强碱性生物碱浓度呈正相关。流式细胞仪对文殊兰强碱性生物碱作用下MCF-7胞浆中Cyt-C表达量的检测实验表明:文殊兰强碱性生物碱能明显提高胞浆中Cyt-C的表达量。给药浓度分别为3μg·mL-1、6μg·mL-1、12μg·mL-1。用激光共聚焦对文殊兰强碱性生物碱作用下MCF-7细胞内Ca2+浓度的检测实验表明:Ca2+浓度随着给药剂量的升高而提高,呈现正相关剂量依赖性。给药浓度分别为3yg·mL-1、6μg·mL-1、12μg·mL-。综上所述文殊兰强碱性生物碱诱导乳腺癌MCF-7凋亡的途径为线粒体途径:文殊兰强碱性生物碱能够使存于内质网内部的Ca2+释放,被释放的Ca2+最终都会进入线粒体内,导致线粒体内部钙超载,损伤线粒体,之后存于线粒体膜内的主要凋亡诱导因子Cyt-C被释放到胞浆当中。Cyt-C能够与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合形成凋亡体,这个凋亡体能够聚合caspase-9,引发一系列反应,最终激活caspase-3,导致细胞凋亡。