本研究论义包括三个部分:(一)斑马鱼的造血发育；(二)斑马鱼髓系造血细胞缺陷大规模化学遗传学筛选；(三)斑马鱼苏丹黑B染色信号缺失.350突变家族的表型鉴定。　　 斑马鱼作为造血发育模式生物的优势斑马鱼(Danio rerio)是一种可以用于研究造血发育的理想的模式生物:1)它具备了许多优良的生物学特征,生长速度快,每周可产卵200-300枚,体积小,容易养殖,可以实现大规模突变筛选:2)体外受精,胚胎透明,可以活体观察造血的全过程。3)斑马鱼的造血系统与其他高等脊椎动物具有高度一致性,许多与哺乳动物造血发育相关的基因都与斑马鱼存在直向同源基因。因此,斑马鱼相关研究成果具有极大的应用价值。4)通过诱变筛选的方法,目前已经获得许多造血过程发生异常的斑马鱼突变株,这为研究造血发育及其相关分了机制提供了重要材料。5)许多新技术的建立以及斑马鱼基因组学的研究进展使得这种模式生物更加受到重视,并且使其成为鉴定新的基因和已知基因新调控途径的有利工具。　　 斑马鱼的造血发育斑马鱼的原始造血出现在胚胎内两个不同的区域:一个为后部侧板中胚层(PLM),该区域后演变成中间细胞群/主动脉-性腺-中肾区(ICM/AGM),相当于哺乳动物的卵黄囊,产生原始红系细胞；另一个区域为前侧中胚层区(ALM),后演变为前部造血岛(RBI),产生原始髓系细胞。Runx1和c-myb的表达被认为是斑马鱼定向造血的开始。定向造血的造血干细胞起源于背主动脉腹侧壁,受精后2天(2dpf)迁移到后部血岛,在该区域进行进一步发育和分化,随后在受精后5天迁移到。肾脏,开始了斑马鱼成鱼期造血。到了受精后13天,肾脏成为斑马鱼成鱼造血的最终器官。　　 斑马鱼的髓系造血研究斑马鱼的髓系造血细胞有两种类型:粒细胞和单核/巨噬细胞,其中粒细胞又有两种细胞系,一种类似于哺乳动物的中性粒细胞,而另一种则代表了哺乳动物中的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。近年来,已经确定了与各髓系及其前体细胞发育有关的分子标记物,如造血干细胞(scl、lmo2),髓系前体细胞(pu.1、c/ebp1),中性粒细胞(mpo),巨噬细胞(1-plastin、fms)。斑马鱼的原始巨噬细胞在受精后16小时左右首先出现在前部造血区,随后粒细胞开始发生,经卵黄囊入循环并迁移至后部ICM区并逐渐分布于全胚胎。在胚胎发育的早期,斑马鱼巨噬细胞具有吞噬细胞样活性,并和中性粒细胞一起参与了急性炎症反应。　　 ENU化学诱变及大规模化学遗传筛选 利用化学诱变剂ENU诱变来进行大规模正向遗传学筛选,是基因研究的重要手段,已广泛用于斑马鱼各个发育阶段及各个器官的发育生物学研究。ENU诱变剂具有很高的诱变效率,且突变体中受影响的基因可以通过定位克隆的方法鉴定出来。雄鱼的精原细胞被诱变以后,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder。(F0)的F1代之间交配产生F2家族,F3代来自F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体。我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼。初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色信号缺失,另3个突变体为苏丹黑染色信号缺失,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍。　　 突变体的初步鉴定 整体原位杂交技术(Whole mount in situ hybridization WISH)可以用来在整体水平上检测斑马鱼中某种特定序列的核酸(包括DNA或RNA)的存在与分布情况,能够显示特定基因的转录产物mRNA的时空表达谱,因此成为斑马鱼基因表达研究的一项重要技术。本研究利用整体原位杂交技术,通过斑马鱼已知的造血细胞特异性标记物fms,mpo,Lysozyme C,ragl,globin βel等对苏丹黑染色信号缺失的350突变体家族作初步鉴定。结果显示,fms,mpo,Lysozyme C,ragl,globin βel等分子标记物均正常表达。经微分干涉差显微镜(differential interference contrast,DIC)分析显示,突变体粒细胞中的颗粒明显减少,因而导致苏丹黑染色信号缺失。