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背景和目的卵巢癌作为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,大多数患者被诊断时已处于晚期,其中浆液性癌占80%以上。70%的患者会在治疗后三年内复发。术后5年生存率只有30%,治疗后10年内保持无瘤状态的患者比例不到15%。免疫疗法作为一种非常有潜力的新型治疗方法,为卵巢癌的治疗带来了新的曙光。目前程序性细胞死亡受体-1(PD-1)/程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)通路的抑制剂在卵巢癌治疗中的应用尚处于研究阶段。由于在上皮性卵巢癌的肿瘤发展中起着重要的作用,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAMs)已经成为治疗上皮性卵巢癌的新理想靶点。因此,探究TAMs上PD-L1的表达,将有助于提高免疫疗法在卵巢癌治疗中的应用效果。研究表明,原发性和转移性卵巢癌的TAMs上均有PD-L1的表达,但其在高级别浆液性卵巢癌(High grade serous ovarian cancer,HGSOC)中的临床意义和表达机制国内外少有报道。本研究目的旨在明确TAMs上PD-L1的表达与预后和临床病理特征间的关系,为其作为预后评估指标提供理论和实验依据;分析卵巢癌细胞对TAMs上PD-L1的表达的调控作用,为PD-L1抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的思路。方法1.免疫组化及免疫荧光:选取2015年1月-2016年12月在郑州大学第一附属医院接受手术治疗,且病理诊断为HGSOC的初治患者83例(平均年龄52.8±8.3岁)、卵巢交界性浆液性囊腺瘤患者15例(平均年龄39.7±11.6岁)、卵巢良性浆液性囊腺瘤15例(平均年龄48.4±19.5岁)。采用免疫组化方法分析PD-L1在肿瘤细胞上的表达和CD163(TAMs标记物)在肿瘤间质中的表达情况,免疫荧光双重染色法分析PD-L1在TAMs上的表达情况。根据染色强度和阳性率将患者分为高表达组和低表达组。分析PD-L1、CD163的表达与患者预后及临床病理特征(绝经情况、手术病理分期和淋巴结转移情况)的关系。2.细胞实验:构建SKOV-3和M2-巨噬细胞的共培养体系。流式细胞术检测培养前、培养1天、2天、3天后,M2-巨噬细胞表面PD-L1表达阳性率的变化。以SKOV-3的培养液配置条件培养基,用于培养M2-巨噬细胞,分别于培养后1天、2天、3天,流式细胞术检测其表面PD-L1表达阳性率的变化。3.统计分析:采用Kaplan-Meier法进行生存分析,多变量Cox 比例风险模型分析预后的影响因素,χ2检验分析PD-L1、CD163的表达与患者临床病理特征的关系。Wilcoxon秩和检验用于比较相邻两天PD-L1阳性率的组间差异。P<0.05视为差异有统计学意义。结果1.肿瘤细胞上PD-L1的表达及临床意义:PD-L1在HGSOC组、交界性组、良性组肿瘤细胞上表达阳性率分别为88%、33%、13%。与交界性和良性组相比,PD-L1在HGSOC中肿瘤细胞上的表达显著上调(P均<0.05)。PD-L1表达阳性率在绝经前后患者中分别为90%、87%,;在Ⅰ-Ⅳ期患者中分别为71%、67%、92%、89%;在淋巴结转移和未转移患者中分别为89%、87%。分别根据绝经情况、手术病理分期、淋巴结转移情况将患者分为两组,肿瘤细胞上PD-L1的表达在上述分组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。肿瘤细胞上PD-L1的高表达组和低表达组之间的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)均无显著差异(P均>0.05)。2.肿瘤间质中CD163的表达及临床意义:CD163在HGSOC组、交界性组、良性组肿瘤间质中表达阳性率分别为95%、53%、13%。与交界性和良性组相比,CD163在HGSOC肿瘤间质中的表达显著增高(P均<0.05)。CD163表达阳性率在绝经前后患者中分别为100%、92%,;在Ⅰ-Ⅳ期患者中分别为86%、83%、79%、100%;在淋巴结转移和未转移患者中分别为98%、92%。CD163的表达高低在不同绝经情况和手术病理分期的组间差异无统计学意义(P均>0.05),淋巴结转移组较未转移组的CD163表达更高(59.1%VS 33.3%,χ2=5.51,P=0.019)。CD163高表达组(中位DFS:21个月)与低表达组(中位DFS:39个月)之间DFS差异有统计学意义(P=0.004),且是术后DFS的独立危险因素(P=0.017,HR=0.493,95%CI:0.276-0.883)。3.TAMs上PD-L1的表达及临床意义:92%的HGSOC患者组织中可见TAMs上PD-L1的表达,其在绝经前后患者中的表达的比例分别为93%、91%,;在Ⅰ-Ⅳ期患者中分别为100%、83%、92%、89%;在淋巴结转移和未转移患者中分别为91%、92%。TAMs上PD-L1的表达高低在不同绝经情况和手术病理分期的两组间差异无统计学意义(P均>0.05),其在淋巴结转移组较未转移组表达更高(63.6%VS 35.9%,χ2=6.37,P=0.012)。TAMs 上 PD-L1 高表达组(中位 DFS:25个月)与低表达组(中位DFS:39个月)之间DFS差异有统计学意义(P=0.022),且是术后 DFS 的独立危险因素(P=0.035,HR=0.503,95%CI:0.266-0.952)。4.肿瘤细胞对TAMs上PD-L1表达的影响:SKOV-3与M2-巨噬细胞共培养体系中,共培养前、培养1天、2天、3天后,M2-巨噬细胞表面PD-L1表达阳性率分别为(2.2±0.7)%、(16.9±2.0)%、(42.9±1.7)%、(58.2±1.6)%,相邻两天之间阳性率的差异均有统计学意义(P均<0.05)。于SKOV-3条件培养基中,培养1天、2天、3天后,M2-巨噬细胞表面PD-L1表达阳性率分别为(25.7±1.2)%、(62±1.8)%、(84±2.0)%,相邻两天之间阳性率的差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论1.HGSOC肿瘤组织中TAMs的浸润程度增加,且TAMs的高度浸润是患者术后DFS的独立危险因素,TAMs可能成为预测卵巢癌预后的新标志物。2.卵巢癌细胞可上调M2-巨噬细胞表面PD-L1的表达,TAMs上PD-L1的高表达预示患者不良预后,提示TAMs表达的PD-L1有望成为治疗卵巢癌的新靶点。