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第一部分 TM4基因真核表达载体及慢病毒表达载体的构建与鉴定 目的:分别构建人四穿膜(TM4)基因与小鼠TM4基因的真核表达载体，及其慢病毒表达载体，为下一步TM4基因功能研究奠定基础。 方法: 1)分别以人TM4质粒、小鼠cDNA为模板，通过PCR扩增出人TM4基因[TM4(h）]与小鼠TM4基因[TM4(m)]的开放阅读框(ORF); 2)将TM4(h)、TM4(m)基因克隆到真核表达载体pcDNA中，并用酶切、测序证实插入的基因序列的正确性; 3)进一步用pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m)质粒转染HEK93细胞，RT-PCR以及westrn-blot方法证实质粒构建成功并且能够正确表达TM4; 4)分别以慢病毒包装TM4(h)、TM4(m)表达载体，并经293TN细胞感染证实病毒包装成功; 5)收集细胞上清，用梯度稀释法检测病毒滴度。用TM4(h)、TM4(m)慢病毒分别感染THP-1细胞与3T3-L1细胞，确定最佳感染复数(MOI)值。 结果: 1)成功构建TM4(h)、TM4(m)的真核表达载体pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m)，经鉴定证实序列正确，质粒转染细胞可以正确表达TM4蛋白。 2)成功包装表达TM4(h)、TM4(m)基因的重组慢病毒载体，经细胞感染实验证实病毒包装成功。 3)细胞上清液中的TM4(h)病毒滴度为1.56×104 ifu/ul，TM4(m)病毒滴度为1.67×104 ifu/ul。 4)慢病毒感染THP-1细胞与3T3-L1细胞的最佳MOI值分别为8与18.4。 结论:成功构建TM4(h)、TM4(m)真核表达载体及重组慢病毒载体。能在293TN细胞中正确表达，为后续实验奠定了基础。 第二部分 TM4负调控Nur77-IKKβ-NF-kB通路并能抑制高脂诱导的代谢性炎症 目的:研究TM4对Nur77-IKKβ-NF-kB通路以及高脂诱导的慢性炎症的影响。 方法: 1)按照之前确立的最佳MOI，用增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的TM4(h)、TM4(m)重组慢病毒分别感染THP-1与3T3-L1细胞，两种细胞分别设立空病毒感染及空白对照。 2)用终浓度1mM的软脂酸及油酸混合物(1∶1)分别处理已感染慢病毒的THP-1与3T3-L1细胞。 3)采用Real-time PCR及Western blot检测TM4、Nur77、IKKβ、NF-kB p65在mRNA与蛋白水平的表达差异。 结果: 1)慢病毒感染后961h，有绿色荧光蛋白表达的细胞数接近细胞总数的100％。Real-time PCR及Western blot检测显示，感染TM4重组慢病毒后，TM4基因明显上调; 2) Real-time PCR及Western blot检测显示，对于THP-1细胞及3T3-L1细胞，高脂均能下调TM4表达，激活Nur77、IKKβ、NF-kB p65、TNF-α等炎症基因; 3)TM4过表达，可明显下调Nur77、IKKβ、NF-kB p65、TNF-α的mRNA水平及其蛋白表达，抑制高脂诱导的炎症激活。 结论:TM4能负调控Nur77-IKKβ-NF-kB通路，抑制高脂诱导的代谢性炎症激活。 第三部分 TM4过表达能改善高脂喂养db/db小鼠的代谢性炎症与胰岛素抵抗 目的:观察过表达TM4基因后db/db小鼠的表型变化。 方法:将2周龄的雄性db/db小鼠30只随机分为3组（生理盐水、空病毒、TM4慢病毒)，每组10只，喂以高脂饲料。3组小鼠每周经尾静脉分别注射生理盐水、空病毒、TM4慢病毒1次，每次1ml，病毒液浓度为1×104 ifu/ul。每周监测小鼠的体重、进食量、空腹血糖、尾动脉血压变化。饲养10周后(12周龄)，腹腔注射葡萄糖检测小鼠糖耐量(IPGTT)，次日将小鼠麻醉处死，取血检测血脂、空腹胰岛素、炎症因子;取骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织，行Real-time PCR及Western blot检测TM4及其下游Nur77-IKKβ-NF-kB炎症通路表达水平，甲醛固定石蜡包埋观察肝脏与附睾脂肪组织病理变化。 结果: 1) Real-time PCR及Western blot显示:感染TM4(m)慢病毒的小鼠骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织中的TM4表达均明显上调; 2)慢病毒干预10周后，TM4过表达组db/db小鼠的HOMA-IR、空腹血糖、空腹胰岛素、体重、收缩压、平均压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平显著低于对照组，而进食量无显著差异; 3)糖耐量试验显示:TM4过表达小鼠的0min，30min，60min,120min血糖及IPGTT曲线下面积均显著低于对照组; 4)组织HE染色显示:对照及空病毒组小鼠肝细胞内有大量脂滴形成，呈明显脂肪肝表现，而TM4过表达组肝细胞未见明显气球样变;TM4过表达组小鼠的附睾脂肪细胞体积小于对照及空病毒组; 5) TM4过表达组db/db小鼠骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织中的Nur77、IKKβ、磷酸化NF-kB的表达均明显下调，血清炎症因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)水平显著低于对照组。 结论:TM4过表达能改善高脂喂养db/db小鼠的代谢性炎症与胰岛素抵抗，这可能源于TM4对Nur77-IKKβ-NF-kB炎症通路的抑制。