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背景急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一组由获得性和偶然的遗传性基因改变引起的高度异质性的造血干细胞和前体细胞的恶性克隆性增殖性疾病,在成人急性白血病中约占70%。随着基础研究工作的深入开展及临床治疗手段的不断改进,AML的预后有了显著改善。然而,五年生存率仍只有10%-30%。目前,AML的发病机制尚不完全明确,对于难治复发的病人及老年病人的治疗方案仍需不断探索改进。DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)在血液恶性肿瘤中的研究尚不完全清楚。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)是DNA损伤修复过程中最重要的基因之一。据报道PARP-1在AML中高表达,而DNA损伤修复的另外一个重要基因BRCA1在AML中低表达。当治疗药物造成白血病细胞DNA损伤时,修复功能的丧失会导致基因组改变的积累,最终导致细胞死亡。因此PARP-1抑制剂可能成为AML治疗的一种极具潜力且有效的药物。目的通过收集健康人及AML病人骨髓标本,利用q-PCR检测PARP-1 mRNA的表达量,根据PARP-1的表达,分析PARP-1表达和临床预后的关系,验证PARP-1在AML中的异常表达及其表达对AML的预后影响。探究PARP-1抑制剂BMN673联合SAHA-bendamustine化合物NL101对AML细胞的抑制作用及联合效应,通过体外细胞实验探索联合用药的作用机制,体内实验证明联合用药的安全性及有效性。此外,还初步探索了 PARP-1抑制剂BMN673联合HHT对FLT3-ITD突变的AML的作用及机制。方法1.收集AML病人及健康人骨髓血,分离骨髓单个核细胞,提取RNA检测PARP-1 mRNA表达。收集病人的临床资料包括疾病诊断时间,性别,年龄,初发时的外周血白细胞和血小板计数,血红蛋白量,骨髓原始细胞比例,染色体核型,基因突变类型,治疗方法,治疗效果,生存时间等资料,根据PARP-1的表达水平,将病人分组,使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验绘制并比较生存时间曲线。使用多变量Cox比例风险模型来识别调整混杂因素后的独立结果预测因子。2.将PARP-1抑制剂BMN673及SAHA-bendamustine化合物NL101单独及联合作用于急性髓细胞白血病细胞系及原代病人细胞,检测生长抑制作用,计算联合指数,流式细胞技术检测药物对细胞的凋亡及周期阻滞作用。收集单药及联合药物作用后的细胞,并用定量PCR、western blot、免疫荧光等验证药物作用后凋亡相关蛋白,周期相关蛋白及DNA损伤相关信号通路蛋白的改变。3.BMN673联合NL101对AML动物模型的体内研究。将MV4-11-luc或MOLM-13细胞经尾静脉注射到NSG小鼠诱导AML发生。通过荧光成像仪检测小鼠体内肿瘤负荷,并在小鼠发病后分别给予安慰剂、BMN673、NL101和BMN6731联合NL101治疗。每周通过荧光成像检测小鼠体内肿瘤负荷,每3天记录小鼠体重。待小鼠双下肢瘫痪时处死小鼠,收集骨髓血细胞检测human-CD45的表达,记录各组小鼠生存时间,进行生存分析。HE染色检测小鼠脾脏肿瘤细胞浸润程度。4.BMN673与HHT单独及联合作用于FLT3-ITD突变与非突变的急性髓细胞白血病细胞系及AML患者原代细胞,检测生长抑制作用,计算联合指数,流式细胞技术检测药物对细胞的凋亡作用。收集单药及联合用药作用后的细胞,并用western blot,免疫荧光验证药物作用后凋亡相关蛋白、DNA损伤相关通路、FLT3激酶相关蛋白的改变。结果1.339例正常核型AML(CN-AML)病人及AML细胞系的PARP-1的表达水平高于正常对照组。PARP-1高表达的病人的总生存时间(OS)及无事件生存时间(EFS)短于低表达病人(中位生存时间OS:646 vs 374;EFS:425 vs 240,天)。PARP-1高表达是AML预后不良的独立危险因素(HR:OS:1.949(1.384,2.745),P<0.001;EFS:1.822(1.323,2.509),P<0.001)。2.PARP-1高表达组的病人的外周血白细胞计数(17.00×109/L[3.60×109-87.20×109]vs 9.65×109/L[2.42×109-38.60×109],P=0.008)及骨髓原始细胞比例(72.00%[51.50-85.00]vs 63.00%[37.00-78.38],P=0.003)高于低表达组,PARP-1高表达组病人的FLT3-ITD突变频率(28.2%vs 17.3%,P=0.031)高于低表达组。3.PARP-1抑制剂BMN673联合NL101显著抑制白血病细胞的生长,联合组相比于单药明显将AML细胞周期阻滞在G2/M期,上调CDK抑制蛋白P21,G2/M周期检测点蛋白CyclinB1、p-CDC2的表达。联合组明显增加AML细胞凋亡,上调凋亡信号蛋白Cleaved Caspase3以及Cleaved PARP-1的表达。4.BMN673联合NL101明显增加白血病细胞的γ-H2AX的表达,上调DNA损伤通路信号蛋白p-ATM、p-CHK1和p-CHK2,并抑制DNA修复蛋白poly-ADP(PAR)及 RAD51 的表达。5.BMN673联合NL101相比于单药能明显降低白血病小鼠的体内白血病细胞的负荷,延长小鼠的生存时间,降低小鼠骨髓hCD45,减少小鼠脾脏的白血病细胞的浸润。6.BMN673联合HHT能协同抑制FLT3-ITD突变的AML细胞的生长,促进凋亡,增加DNA损伤,抑制FLT3及p-FLT3激酶。结论本研究中,我们发现PARP-1基因在CN-AML中高表达,PARP-1高表达的病人骨髓原始细胞比例及外周血白细胞计数以及FLT3-ITD突变频率更高。高表达组病人的OS和EFS明显短于低表达组。PARP-1高表达是CN-AML预后不良的独立危险因素。利用PARP-1抑制剂BMN673联合SAHA-bendamustine化合物NL101能协同抑制白血病细胞的生长,促进AML细胞的DNA损伤,抑制DNA损伤的修复,增加白血病细胞凋亡。联合用药能有效抑制AML小鼠的体内肿瘤负荷,延长小鼠的生存时间。此外,我们还发现BMN673联合HHT能协同抑制FLT3-ITD突变的急性髓细胞白血病。