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研究目的:非小细胞肺癌已成为世界上发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一,近年来研究表明氨酰-tRNA合成酶(AARS)除具有经典的催化作用外,还与恶性肿瘤、炎症、免疫系统疾病、感染等其他疾病的相关。异亮氨酸-tRNA合成酶2(IARS2)作为AARS成员之一,最近研究表明其与肿瘤发生之间存在一定相关性,然而其与肺癌的关系尚未可知。为了研究IARS2在非小细胞肺癌中的作用及机制,我们评估了56例非小细胞肺癌患者肺癌组织及癌旁正常组织标本,采用Western Blot方法观察IARS2蛋白在肺癌组织中的表达情况,同时分析了其表达水平与肺癌患者临床病理特征相关性。通过慢病毒sh RNA技术稳定干涉IARS2表达,并应用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术(Annexin V/7-AAD染色、PI/RNase染色)、Western Blot方法评估IARS2对非小细胞肺癌细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期分布、细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响;应用裸鼠皮下移植瘤实验评估IARS2对于非小细胞肺癌体内成瘤能力的影响;应用Gene Chip primeview human人基因表达谱芯片及IPA(Ingenuity?Pathway Analysis)评估IARS2基因沉默的表达谱及功能分析;应用Western Blot、RT-PCR、回复实验等方法对分子机制进行探讨。本研究有助于阐明IARS2在肺癌发生发展中的分子生物学机制,为探寻肺癌治疗新驱动基因及分子靶向治疗奠定基础。研究方法:1.采用Western Blot方法检测人非小细胞肺癌组织及肺癌细胞系(A549、H1299)与支气管上皮细胞系(BEAS-2B)中IARS2蛋白表达丰度,并统计分析IARS2蛋白与临床病理特征(包括组织类型、性别、年龄、吸烟史、TNM分期情况)的相关性。2.采用慢病毒sh RNA技术建立稳定干涉IARS2肺癌细胞系,并应用CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术(Annexin V/7-AAD染色、PI/RNase染色)检测敲低IARS2对肺癌细胞株增殖活力、克隆形成能力、凋亡差异及细胞周期分布的影响。3.Western Blot方法检测凋亡蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase9、Bax、Bcl-2表达水平,评估IARS2对非小细胞肺癌细胞凋亡蛋白的影响。4.采用Gene Chip primeview human人基因表达谱芯片检测IARS2敲低前后的差异基因表达并应用Ingenuity Pathway Analysis软件进一步分析差异表达基因与经典通路、上游调节因子、疾病和功能的关系。5.将阴性对照组及基因沉默组细胞接种于裸鼠皮下,建立体内异种移植瘤模型,观察体内情况下,敲低IARS2对肺癌细胞增殖的影响。6.采用Western Blot方法检测AKT/MTOR信号转导通路的相关蛋白(p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、AKT、p-MTOR、MTOR)表达水平,并应用新型AKT激活剂SC79处理A549细胞,分别应用CCK-8及Western Blot方法检测增殖情况及通路蛋白的表达水平,评估IARS2对AKT/MTOR信号通路的影响。结果:1.与癌旁组织相比,IARS2蛋白在非小细胞肺癌组织中表达显著增高,其中腺癌中IARS2高表达率占72.73%,鳞癌中IARS2高表达率为64.71%,腺癌略高于鳞癌。IARS2蛋白水平表达可能与患者肿瘤的T期(P=0.036)和N期(P=0.037)相关,而与病理类型、年龄、性别、吸烟史无关。与支气管上皮BEAS-2B细胞系相比,肺腺癌细胞系(A549、H1299)IARS2蛋白水平表达明显升高。2.成功建立稳定敲低IARS2的A549和H1299细胞株,与Control组相比,shIARS2-1组和shIARS2-2组细胞增殖活力显著下降,在72h、96h和120h差异具有统计学意义(P<0.05);shIARS2-1组和shIARS2-2组细胞克隆形成能力显著下降;shIARS2-1和shIARS2-2组G0-G1期细胞比例显著增多,S期比例显著减低;与A549 Control组比较,shIARS2-1组和shIARS2-2组凋亡率显著增高(P<0.05)。3.凋亡相关蛋白检测结果显示,与Control组相比,shIARS2-1组与shIARS2-2组cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase9、Bax相对表达量明显增高,而Bcl-2相对表达量明显降低,说明敲低IARS2基因可促进凋亡蛋白的表达增高,IARS2至少在一定程度上通过调节线粒体凋亡通路发挥其生长抑制作用。4.人基因表达谱芯片及IPA分析结果显示,IARS2表达调控A549细胞中742个基因的表达,其中507个基因在IARS2沉默后上调,235个基因下调;差异表达基因与经典通路、上游调控因子、疾病和功能之间的关系;差异调控基因与353个典型通路相关;预测259种IARS2沉默后将被激活的疾病或功能,预测132种被抑制的疾病或功能;预测IARS2沉默后,转录因子、细胞因子、小RNA、受体、激酶、化学分子和药物等951个分子被激活,483个分子被抑制。5.AKT/MTOR通路蛋白检测结果显示,与Control组相比,shIARS2-1组与shIARS2-2组p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-MTOR、MTOR较Control组蛋白相对表达量明显减低,而AKT蛋白相对含量无明显差异,说明敲低IARS2可通过抑制AKT/MTOR信号通路中AKT/MTOR蛋白磷酸化,进而抑制该通路的激活。6.加入激活剂SC79后的shIARS2-1组与shIARS2-2组A549细胞的p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-MTOR蛋白相对表达水平高于未加激活剂组shIARS2-1组与shIARS2-2组,但低于Control组;与未加入激活剂组比较,加入激活剂SC79后shIARS2-1组与shIARS2-2组细胞增殖率水平显著升高(P<0.05),但仍低于Control组(P<0.05),说明激活剂SC79可部分恢复IARS2沉默诱导的肺癌细胞增殖抑制作用。7.shIARS2-1组与shIARS2-2组小鼠的肿瘤体积、瘤重显著低于对照组,肿瘤生长速度明显降低,说明在小鼠体内敲低IARS2基因可抑制肿瘤增殖。结论:1.IARS2可调控多种基因的表达发挥其生物学功能,参与多种疾病和功能的发生。2.IARS2在人非小细胞肺癌组织中表达上调,与患者肿瘤的T期和N期正相关。3.敲低IARS2抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,在一定程度上通过调节线粒体凋亡通路发挥其生长抑制作用。4.敲低IARS2可抑制AKT、MTOR蛋白磷酸化,激活剂SC79可部分恢复IARS2沉默诱导的肺癌细胞增殖抑制作用,提示IARS2可能通过AKT/MTOR信号通路调控肺癌细胞的增殖。