随着生活水平的提高和生活方式的改变,急性冠脉综合征和脑卒中等严重影响人类健康和生活质量的心脑血管疾病发病率明显增加,已成为目前国内、国际致残和导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化是此类疾病的主要病理基础,易损斑块破裂和血栓形成则与其发病机制密切相关。动脉粥样硬化是一个复杂的多因素的病理生理过程,系统性炎症反应在动脉粥样硬化的发生和发展的各个阶段都起着重要的作用,包括斑块的不稳定期以及最后的斑块破裂过程。不稳定斑块即易损斑块的形成和破裂与基质金属蛋白酶(MMPs)密切相关。MMPs是与细胞外基质蛋白质降解密切相关的蛋白水解酶,在一系列炎症因子如IL-1、TNF-α、CD154及活化的T淋巴细胞的刺激下由巨噬细胞和血管平滑肌细胞分泌。目前识别和定性的MMPs有23种,其中MMP-9与动脉粥样硬化斑块破裂的关系最密切,且相关研究最多。诸多研究显示,急性冠脉综合征(ACS)患者血清MMP-9水平显著高于稳定性心绞痛患者,而且病理研究显示,ACS患者冠状动脉易损斑块中MMP-9水平表达显著高于稳定性斑块中。动脉粥样硬化动物模型显示,易损斑块肩部富含巨噬细胞的区域高表达MMP-9,另有研究显示诱导小鼠动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞过表达有活性的MMP-9时显著增加弹力蛋白的降解,导致斑块破裂。因此,抑制MMP-9表达可能对防治易损斑块破裂产生积极影响。目前临床上面临非常棘手的问题：如何在无症状人群中发现易损斑块以及如何治疗易损斑块。近年来随着对易损斑块的不断认识和各种技术的不断开发,诊断易损斑块成为现实。如检测MMPs、C-反应蛋白与高敏C-反应蛋白、氧化脂蛋白等有利于检出易损斑块高危人群；通过冠状动脉造影、血管内超声以及血管内光学相干断层成像技术能够判断易损斑块,但是作为常规检查明显受限。目前包括他汀类药物在内的系统性药物干预治疗,对预防和治疗动脉粥样硬化性疾病已经取得了显著的成效,但是仍然不能预防冠心病的反复发作。相关研究认为,采用针对斑块的易损机制利用分子生物学技术靶向治疗,可能是对预防冠心病的反复发作具有前途的治疗方法。由于MMP-9高表达与易损斑块的破裂密切相关,因此,本研究设想MMP-9是良好的基因干预靶点,而且抑制MMP-9在动脉粥样硬化斑块内表达可能达到预防易损斑块破裂乃至防治ACS的作用。目前常用的抑制基因表达的方法有RNA干扰(RNAi)。RNAi是近年来发展起来的选择性抑制特定基因表达的一种分子生物学技术,是双链RNA分子在mRNA水平上诱发序列特异性的转录后基因表达沉默现象,目前广泛应用于基因功能研究和某些疾病的基因治疗研究中。RNAi在体内靶细胞中发挥作用需要载体作为媒介。慢病毒载体是常用的载体之一,由于慢病毒具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点,且慢病毒载体介导的RNAi作用时间持久,不易诱发宿主免疫反应,因此,本研究拟采用慢病毒作为载体、利用RNAi技术抑制斑块内MMP-9表达,以观察其对动脉粥样硬化的影响,为防治易损斑块尝试一种新途径。为此,本研究首先在体外构建针对靶向干扰MMP-9的慢病毒载体,并在体外细胞实验中验证其干扰效应；然后将RNA干扰慢病毒载体转染ApoE-/-′小鼠,同时建立动脉粥样硬化模型,最后观察对动脉粥样硬化斑块的影响。一、MMP-9 RNA干扰慢病毒载体的构建实验方法：针对小鼠MMP-9基因序列,用Ambion公司的设计软件,设计、合成双链DNA oligo,连接到酶切后的pGCL-GFP载体上,构建重组质粒,然后进行PCR鉴定和测序分析。结果：成功构建pGCL-GFP/MMP-9质粒,琼脂糖凝胶电泳与基因测序表明所获得序列与Gene Bank中的MMP-9基因序列一致。二、MMP-9真核表达载体的构建实验方法：从cDNA文库中利用PCR方法钓取MMP-9基因,与pGCL-GFP载体分别双酶切后重组,其产物转化感受态细胞,PCR鉴定；重组质粒转染293T细胞,48小时后在荧光显微镜下观察MMP-9表达。结果：PCR鉴定为阳性克隆,说明MMP-9基因已经定向转入pGCL-GFP载体；荧光显微镜下可观察到293T细胞表达绿色荧光蛋白,说明MMP-9在293T细胞内表达。三、小鼠MMP-9 RNA干扰慢病毒载体在体外的沉默效应实验方法：将构建好的MMP-9 RNA干扰慢病毒载体与MMP-9真核表达载体首先共转染293T细胞,应用Western blot检测MMP-9在蛋白水平上的沉默效应；其次共转染NIH3T3细胞和Raw264.7细胞,应用Real-time PCR检测MMP-9的mRNA表达情况,进而判断其干扰效果；在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,进而判断其沉默效应。结果：Western blot显示,与阴性对照组比较,干扰组对MMP-9有显著的敲减作用；Real-time PCR显示,干扰组在NIN3T3细胞和Raw264.7细胞上对MMP-9mRNA基因表达有显著的干扰作用,干扰效率75%以上,与正常对照组和阳性对照组比较,有显著性差异(P<0.001)；在荧光显微镜下可观察到,干扰组细胞中绿色荧光蛋白表达明显少于对照组。四、慢病毒介导的MMP-9 RNA干扰对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响实验方法：将10周龄的ApoE-/-′小鼠分成3组(每组n=10),即PBS组、Lentiviruses-GFP组和Lentiviruses-MMP-9干预组,分别经尾静脉注射PBS、Lentiviruses空载体和Lentiviruses-MMP-9,给予高脂饲养20周后检测斑块面积；斑块内MMP-9和血管平滑肌细胞(SM-actin)抗原的免疫活性；同时测定三组血清MMP-9和hs-CRP水平。结果：HE染色显示,三组的平均斑块面积无明显差异,三组的平均面积分别为：PBS组0.99±0.14mm2, GFP组0.96±0.13mm2, MMP-9干预组1.02±0.10mm2,但是发现与PBS组和Lentiviruses-GFP组比较,Lentiviruses-MMP-9干预组的斑块肩部巨噬细胞数量明显减少,而纤维帽增厚。MMP-9干预组与前两组比较,SM-actin抗原活性明显增强,而MMP-9抗原活性明显减弱。PBS组和GFP组的血清MMP-9和hs-CRP水平无明显差异(分别是：798.7±115.1μg/L vs 801.3±129.4μg/L和3.48±0.34mg/L),而MMP-9干扰组的血清MMP-9和hs-CRP水平(728.5±208.1μg/L和2.43±0.22mg/L)明显低于PBS组和GFP组,P<0.01。本课题研究发现,利用RNA干扰慢病毒载体转染ApoE-/-′小鼠,抑制斑块内MMP-9表达,使斑块表面的帽增厚,促进斑块趋于稳定,保护斑块避免破裂。其可能作用机制：慢病毒具有可感染非分裂期细胞和作用时间持久的特点,因此,可能持续抑制斑块内MMP-9表达,从而减少细胞外基质降解,使纤维帽增厚；另一方面可能促进血管平滑肌细胞向斑块表面移行和迁移,从而使斑块表面增厚,减少血浆中炎性介质和MMP-9水平同样可能是使斑块趋于稳定的一种机制。本课题利用分子克隆、免疫荧光、Real-time-PCR和Western-blot等实验技术,研究了MMP-9 RNA干扰慢病毒载体对高脂饲养poE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响,体内干扰与动脉粥样硬化斑块易损性密切相关的MMP-9表达,在细胞和分子水平上为治疗易损斑块提供了实验依据。