第一章CXCL12/CXCR4轴在食管鳞癌组织中的表达及其与预后的关系 目的：新近研究显示CXCL12/CXCR4轴在多种肿瘤组织中有表达，并与肿瘤细胞的增殖、侵袭特性相关；本研究旨在检测CXCL12及其受体CXCR4在食管鳞癌中的表达，研究两者对食管鳞癌预后的影响及其与临床及病理因素之间的关系。 方法：应用免疫组织化学法检测186例食管鳞癌组织标本及20例正常食管上皮组织标本中CXCR4、CXCL12蛋白的表达情况，CXCR4、CXCL12表达阳性组与阴性组生存分析用Kaplan-Meier法，组间比较用log-rank检验，多因数分析采用Cox回归多因数模型，CXCR4和CXCL12在食管鳞癌组织中表达与各临床、病理因数的相关性采用x2检验。 结果： 1)CXCR4、CXCL12蛋白在食管鳞癌组织及正常食管上皮组织中的表达 CXCR4蛋白在食管鳞癌组织细胞中阳性表达呈点状，主要定位于细胞膜和细胞浆，经免疫组化染色后呈棕黄色，表达率为67.2％；CXCL12蛋白在食管鳞癌组织细胞中阳性表达主要定位于细胞膜和细胞浆，呈浅棕色颗粒状，表达率为63.4％。CXCR4及CXCL12蛋白在20例正常食管上皮组织中均无表达。 2)CXCL12、CXCR4及多个临床、病理等因素的食管鳞癌预后多因素分析 将血型(分为B型与非B型组)、病理组织分化(分为高分化组与中低分化组)、PTNM分期(分为Ⅱ期组与Ⅲ期组)、年龄(分为<60岁组与≥60岁组)、肿瘤长度(分为<5cm组与≥5cm组)、肿瘤位置(分为胸上段组、胸中段组和胸下段组)、切缘情况(分为切缘阳性组和切缘阴性组)、术后辅助治疗(分为术后放化疗组和无放化疗组)、CXCR4(分为表达阳性组和阴性组)及CXCL12(分为表达阳性组和阴性组)等因数引入COX模型进行多因数分析，结果显示：PTNM分期(P=0.000)及CXCR4的表达(P=0.001)是影响食管鳞癌根治术后患者预后的独立因数。 3)生存分析 本组病例总的5年生存率为19.9％。Kaplan—Meier生存分析显示CXCL12阳性组与阴性组5年生存率分别为18.8％及21.0％，差异无统计学意义(P=0.6141)，CXCR4阳性组与阴性组5年生存率分别为2.2％及28.5％，差异具有显著性差异(P=0.0003)。 4)CXCR4及CXCL12表达与各临床病理特征的关系 CXCR4的表达与T分期(r=0.226)及N分期(r=0.477)呈正相关(p<0.05)，与CXCL12的表达无关(P=0.582)。 结论： 1、CXCL12/CXCR4轴在食管鳞癌组织中有较高的表达，在正常组织无表达； 2、CXCR4的表达水平与食管肿瘤的发展及预后有密切关系； 3、CXCR4的表达与食管鳞癌淋巴结转移及肿瘤局部浸润有关； 4、CXCR4与CXCL12在食管鳞癌的表达无相关性。 第二章慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4在食管鳞癌细胞株EC9706、ECA109的表达 目的：探讨运用慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109细胞表达的可行性。 方法：1)运用QPCR检测CXCR4在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109的mRNA表达；2)运用细胞免疫化学法及免疫印迹法(Western—blot法)检测CXCR4、CXCL12在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109的蛋白表达；3)运用慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4基因在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109细胞的表达；4)QPCR及Western—blot法检测CXCR4静默后，CXCR4在EC9706及ECA109的表达情况。 结果： 1)CXCL12及CXCR4在食管癌细胞株EC9706和ECA109均有表达。 2)慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4后，细胞株EC9706及ECA109静默组CXCR4表达较控制组及阴性对照组弱。 结论：慢病毒载体介导shRNA可以高效、特异地静默CXCR4在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109的表达。 第三章CXCL12/CXCR4轴对食管鳞癌细胞株增殖及凋亡的影响 目的：研究CXCL12/CXCR4轴对食管鳞癌细胞株细胞增殖及凋亡的影响，分析其作用机制。 方法：1)MTT法检测不同浓度CXCL12对两种食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109生长的影响，以及静默CXCR4后对食管鳞癌细胞生长的影响。2)流式细胞仪检测CXCL12及静默CXCR4后对食管鳞癌EC9706、ECA109细胞株细胞周期和凋亡的影响。3)Western—blot法检测静默CXCR4前后，Bcl—2在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109表达的变化。4)通过裸鼠体内实验，检测CXCL12/CXCR4轴对食管癌细胞株EC9706及ECA109生物学行为的影响。 结果： 1)CXCL12促进EC9706及ECA109的增殖能力，25ng/ml为最小有效浓度(P<0.05)。 2)应用慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4在食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109的表达后，静默组细胞生长能力较控制组及阴性对照组弱(P<0.05)，阴性对照组与控制组间则无明显差异(P>0.05)。 3)静默组较控制组及阴性对照组，G0/G1期细胞明显增加，S期细胞则减少，细胞凋亡率上升(P<0.05)。 4)静默CXCR4后，在EC9706及ECA109细胞株中，静默组Bcl—2蛋白表达较控制组及阴性对照组减弱。 结论： 1)CXCL12可促进食管鳞癌细胞生长，降低凋亡率。 2)运用慢病毒介导shRNA静默CXCR4可有效地抑制食管鳞癌细胞生长，提高凋亡率。 3)静默CXCR4后，Bcl—2蛋白表达下调可能是导致食管癌细胞凋亡率升高的机制之一。 第四章CXCL12/CXCR4轴对食管鳞癌细胞株侵袭、运动、粘附的影响 目的：观察CXCL12/CXCR4轴对体外培养的食管鳞癌细胞侵袭、运动、粘附能力的影响。探讨CXCL12/CXCR4轴在食管鳞癌转移过程中所起的作用，运用慢病毒载体介导shRNA静默CXCR4，抑制食管鳞癌转移倾向的可能性。 方法：通过侵袭实验、划痕实验、粘附实验分别检测CXCL12/CXCR4轴对食管鳞癌细胞株EC9706、ECA109细胞侵袭、移动、粘附能力的影响。 结果： 1)CXCL12诱导EC9706、ECA109细胞穿过仿人基地膜，呈剂量依赖性，CXCL12浓度为50ng/ml时诱导效果明显。 2)在相同浓度CXCL12(200ng/ml)诱导下，EC9706及ECA109细胞的静默组与控制组及阴性对照组比较，穿透仿人基底膜细胞数明显减少(p=0.000)。 3)EC9706、ECA109细胞5天爬满六孔板，EC9706及ECA109阴性对照组与控制组所需时间相同；EC9706及ECA109静默组所需时间较控制组及阴性对照组长，需6天；两细胞株SDF-1α组所需时间较控制组、阴性对照组及静默组短，需4天。 4)EC9706及ECA109细胞株的控制组及阴性对照组对BME胶粘附能力无明显差别(P>0.05)；EC9706及ECA109细胞株的静默组对BME胶粘附能力较控制组及阴性对照组下降(P<0.05)；加入SDF-1α处理的EC9706及ECA109细胞株对BME胶粘附能力较无处理组的细胞株加强(P<0.05)。 结论： 1)CXCL12可增强食管鳞癌细胞株细胞EC9706及ECA109的移动、粘附、侵袭能力； 2)通过静默CXCR4可抑制体外食管鳞癌细胞株EC9706及ECA109细胞的移动、粘附、侵袭能力。