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本文从以下几部分进行论述： 第一部分 Dyrk1B调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期的机制研究 1.BrdU检测结果表明，在血清饥饿诱导的G0静止期，RPE1 E7细胞与对照RPE1 vector细胞相比，RPE1 E7细胞能够越过G0/G1/S检测点控制进入S期。因为p27是细胞周期抑制蛋白，Western blot结果表明，静止状态下，RPE1 E7细胞p27蛋白表达水平比RPE1 vector细胞p27蛋白表达水平高。 2.用液相色谱和串联质谱技术(LC/MS/MS)分析p27蛋白的翻译后修饰，鉴定出一个先前在其他细胞系中已知的磷酸化修饰位点p27S10P。 3.用p27的特异磷酸化抗体anti-p27S10P、anti-p27T157、anti-p27T187、anti-p27T198检测并筛选了RPE1 E7细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制的磷酸化修饰，Western blot结果表明，静止状态下的RPE1 E7细胞可发生p27S10P、p27T157、p27T198位点的磷酸化修饰;HPV-16 E7静止状态下可特异性的诱导p27S10、p27T198的磷酸化。 4.筛选RPE1 E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的蛋白激酶，找寻RPE1 E7细胞静止状态下调控p27S10、p27T198磷酸化的信号转导通路。结合血清饥饿处理可以激活Dyrk1B蛋白激酶的活性特点;Dyrk1B可能是RPE1E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶。 5.Dyrk1B蛋白激酶在RPE1 E7细胞中的表达量(mRNA和蛋白水平)、细胞定位、蛋白功能以及Dyrk1B调控HPV-16 E7蛋白稳定性研究。 (1)Dyrk1B在E7细胞中的表达水平及细胞定位。 比较RPE1 vector和RPE1 E7细胞，Dyrk1B无论是mRNA水平还是蛋白水平在RPE1 E7细胞表达量都高于RPE1 vector细胞。Dyrk1B在饥饿处理下对E7表达细胞进入S期似乎起正调控作用。可能是因为Dyrk1B的核浆定位发生了变化。 (2)Dyrk1B在E7蛋白表达细胞中的蛋白功能: Dyrk1B调控E7蛋白表达细胞在静止状态下进入S期。结论，Dyrk1B对E7细胞在静止状态下进入S期起正调控作用。 (3)本部分实验目的是研究Dyrk1B如何调控HPV-16 E7的，主要是Dyrk1B激酶调控HPV-16 E7基因和蛋白两方面。结论，尽管Dyrk1B激酶不影响HPV-16E7基因水平变化，但影响HPV-16 E7蛋白稳定性。 6.Dyrk1B是RPE1 E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶，同时Dyrk1B特异性调控E7蛋白表达细胞静止状态下进入S期，所以这部分的研究内容一方面是Dyrk1B如何磷酸化修饰p27S10和p27T198，另一方面是p27S10、p27T198磷酸化修饰对E7蛋白表达细胞由静止状态下进入S期的影响。 第一部分研究结果表明，HPV E7细胞静止状态下在p27蛋白表达量高的情况下进入S期;E7细胞中p27蛋白在Serine10、T198位点磷酸化程度比对照vector细胞增高，E7细胞中p27S10、p27T198磷酸化影响p27蛋白稳定性，所以可以解释为什么HPV-16 E7细胞G0静止期p27蛋白表达量高。p27S10、p27T198影响E7细胞静止状态下进入S期，Dyrk1B是E7细胞静止状态下进入S期调控p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶。因此，HPV-16 E7细胞在G0静止期，虽然p27蛋白表达量高，但仍能越过G0/G1期进入S期。 第二部分 Dyrk1B通过调控p27S10磷酸化修饰影响p27-Cdk4的结合从而调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期机制探讨 第一部分结果表明，Dyrk1B是E7细胞静止状态下进入S期调控p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶，因为p27对cyclins-Cdks具有广泛的抑制活性，所以这一部分主要研究E7细胞静止状态下进入S期p27作为细胞周期抑制蛋白调控的cyclins-Cdks种类及Dyrk1B是如何通过p27S10、 p27T198磷酸化参与调控cyclins-Cdks的。 1.血清饥饿诱导的G0静止期，p27、p27S10P蛋白在胞核胞浆均有表达，但p27S10P的胞核表达量很高;p27-Cdk4、p27S10P-Cdk4蛋白复合体调控HPVE7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 2.Dyrk1B通过影响p27-Cdk4蛋白复合体的结合能力，调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 p27-Cdk4蛋白复合体调控E7表达细胞静止状态下细胞周期变化，Dyrk1B是E7表达细胞血清饥饿处理条件下影响p27蛋白磷酸化修饰及蛋白功能的重要蛋白激酶，所以Dyrk1B是否调控p27-Cdk4结合能力是这部分的研究内容。IP实验检测p27-Cdk4蛋白复合体的结合，结论，Dyrk1B降低p27-Cdk4结合能力调控HPV E7表达细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 3.Dyrk1B磷酸化修饰p27S10P影响p27-Cdk4蛋白复合体的结合，调控HPVE7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 第一部分研究表明，p27S10P磷酸化修饰调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。这部分研究Dyrk1B与p27WT、p27S10A、p27T198A、p27S10AT198A共转染内源p27 siRNA敲除的RPE1 E7细胞，BrdU检测p27WT与p27S10A的S期％;BrdU结果表明，p27S10A的S期％低于p27WT的S期％。结论，Dyrk1B-p27S10P磷酸化修饰调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 4.Dyrk1 B-Cdk4调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 (1)Cdk1 siRNA、Cdk2 siRNA、Cdk4 siRNA转染RPE1 E7细胞，血清饥饿处理下检测S期细胞比例，BrdU结果表明，与对照NC组比较，Cdk siRNA转染组S期细胞比例均降低。 (2)Dyrk1B与Cdk1 siRNA、Cdk2 siRNA、Cdk4 siRNA共转染RPE1 E7细胞，血清饥饿处理下检测S期细胞比例，BrdU结果表明，与对照NC组比较，Cdk4以及Cdk1 siRNA转染组S期细胞比例降低，而Cdk2 siRNA影响不大;结论，Cdk4调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 5.p27S10P磷酸化修饰不影响Cdk4-cyclin D1结合能力，说明p27通过其磷酸化修饰影响p27与Cdk4的结合能力足以反映细胞周期的变化。 如前所述所得结论，p27 mutants通过影响p27与Cdk4的结合能力影响细胞周期的变化，为证明p27 mutants不影响Cdk4-cyclin Di结合能力，p27WT、p27S10A、p27T198A、p27S10AT198A共转染内源p27 siRNA敲除的RPE1 E7细胞，IP实验检测外源p27-Cdk4结合能力，结果表明，p27S10A转染组与p27WT组比较，p27S10A组Cdk4-cyclin D1结合能力与p27WT组比较变化不大。结论，p27S10P磷酸化不影响Cdk4-cyclin D1结合能力;结合前面的实验结果，结论是外源转染实验证明p27S10P磷酸化通过降低p27-Cdk4结合能力能够调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。 6.Cdk4激酶活性检测。通过检测Cdk4底物RB的磷酸化水平，检测Cdk4激酶活性。