角膜移植术后角膜植片出现免疫排斥反应是角膜移植术后最严重的并发症，临床主要表现为移植片上皮受损、出现前房反应及虹膜炎表现、角膜实质层水肿及狄氏膜皱褶，最终角膜植片失活，手术失败。角膜植片免疫排斥反应发生率约为23％，其中年轻患者中较年老患者为高，当患者有多次移植史或术后大量新生血管形成时，排斥反应的发生率则高达50％以上。 近年来，由于世界各国眼科学与器官移植科学研究人员、临床医师和生物学科研人员的共同努力，使角膜植片免疫排斥反应的基础与临床研究取得了巨大进展，新的药物及治疗方法不断涌现，然而寻求有效、廉价、毒副作用小的治疗药物仍是困扰眼科学界的难题之一。随着显微手术技术不断提高、供体材料保存和选择的完善，使角膜移植的适应症不断扩大，成为当今主要的复明手术之一，但与此同时角膜移植术后植片免疫排斥反应的数量也日趋增加。以往应用的防治移植排斥药物如硫唑嘌呤、氨甲喋呤、环磷酰胺和皮质类固醇激素等，它们虽具有广泛的免疫抑制作用，但长期应用则产生严重的毒副作用。新近临床上抗植片免疫排斥反应的局部应用药物主要有环孢霉素A(CsA)及FK506，但CsA的疏水性药理特点使得其到达眼内(角膜内皮和色素膜)的浓度很低，限制了局部用药效果。FK506免疫抑制作用虽远强于CsA，并且已取得了明显的临床治疗效果，但由于其价格昂贵，使得其临床长期应用难以得到普及。 汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)又名粉防己碱，是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要有效成分，早期研究表明汉防己甲素具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛药理作用。Tet可通过钙离子拮抗作用，降低中性粒细胞内的钙离子浓度，降低Ca<2+>-Cam活性，一方面抑制PLA<,2>活性，减少前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子(PAF)等炎性介质释放；另一方面Tet可升高cAMP，减少溶酶体酶释放和氧自由基生成而发挥抗炎作用。除此之外，眼科基础实验研究还证实Tet在抑制免疫性炎症、对抗增生性玻璃体视网膜病变，抑制视网膜母细胞瘤肿瘤细胞增殖方面都有一定的作用。 本研究拟通过现代医学手段，将中药汉防己甲素滴眼液剂型应用于实验性角膜移植术后，观察其抑制角膜植片免疫排斥反应的疗效，并探讨机制，从而为其临床推广使用提供理论依据。 第一部分动物模型制备及汉防己甲素滴眼液有效治疗浓度的筛选 目的：制备大鼠角膜移植免疫排斥反应动物模型，研究汉防己甲素滴眼液治疗角膜移植免疫排斥反应效果，并确定其最佳治疗浓度。 方法建立SD-Wistar大鼠角膜移植排斥反应模型，将实验动物分为5组。Ⅰ组为正常眼组，Ⅱ组为阴性对照组(角膜移植术后应用1.0％甲基纤维素滴眼液)，Ⅲ组为0.39％汉防己甲素滴眼液治疗组，Ⅳ组为0.5％汉防己甲素滴眼液治疗组，Ⅴ组为1.0％汉防己甲素滴眼液治疗组。对各组大鼠角膜植片存活情况、角膜透明性、角膜基质水肿情况、新生血管进行评分比较。应用印迹细胞学(Impression Cytology,IC)、HE、PAS染色技术检测各组结膜杯状细胞情况，并进行比较。通过免疫组织化学HE染色技术对各组角膜植片水肿情况进行比较，对角膜植片炎症细胞进行分类、计数，并进行比较分析。 结果：1.0.3％、0.5％、1.0％汉防己甲素滴眼液治疗组角膜植片中央出现新生血管的时间分别为18.14±2.55d、24.11±2.69d、21.31±2.47d与阴性对照组12.00±2.12d相比，有显著性差异(P<0.01)。各治疗组排斥反应指数(Rejection Index，RI)均明显低于阴性对照组(P<0.01)。III、IV、V组间比较，以IV组RI为最低，并有显著性差异(P<0.05)。2．术后角膜植片细胞类型主要包括：淋巴细胞、异物巨细胞(吞噬细胞)及少量中性粒细胞。观察期间各时间点III、IV、V组植片内淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞数量均少于II组。III、IV、V组间比较，v组各类型炎症细胞数量少于III、IV组(P<0.05)。角膜植片与植床交界手术缝线处可见大量异物巨噬细胞浸润。3．观察期间各时间点结膜杯状细胞数量比较发现，II、III、IV、V组数量均少于I组(P<0.01)，IIl、IV、V组数量均多于II组，III、IV、V组间比较以IV组数量为多，并有显著性差异(P<0.05)。 结论：各治疗浓度汉防己甲素滴眼液对角膜移植术后免疫排斥反应均有一定的抑制作用，其中0.5％浓度Tet治疗效果较佳，对眼表毒副作用最轻，有望在角膜移植免疫排斥反应的防治中发挥一定作用。 第二部分汉防己甲素滴眼液及联合地塞米松滴眼液 治疗角膜移植排斥反应的研究 目的：研究0.5％汉防己甲素滴眼液及联合0.1％地塞米松滴眼液治疗角膜移植免疫排斥反应效果，并探讨其免疫学抑制机制。 方法：建立SD—Wistar大鼠角膜移植排斥反应模型，将实验动物分为4组。I组为阴性对照组(角膜移植术后应用1.0％甲基纤维素滴眼液)，II组为0.5％汉防己甲素滴眼液治疗组，III组为0.1％地塞米松滴眼液治疗组，IV组为0.5％汉防己甲素滴眼液+0.1％地塞米松滴眼液联合用药治疗组。实验观察期间对各组大鼠角膜植片存活情况、角膜透明性、角膜基质水肿情况、新生血管进行评分比较。于术后不同时间点(7d、14d、21d、28d)取下角膜，HE染色观察各组角膜组织病理变化；对各类型炎症细胞进行分类、计数、比较。运用免疫组织化学方法比较观察期间各组间转化生长因子β1(Transforming growth factor，TGF-β1)、细胞间粘附分子(Intercellular adhesionmolecule，ICAM-1)、RANTES(Regulated upon activation normal T cell expressedand secreted)、碱性成纤维细胞生长因子(basis-Fibroblast growth factor，b—FGF)、核转录因子-kB(Nuclear factor-kB，NF-kB)的表达水平和部位。于排斥反应前期、排斥反应期及排斥反应后期运用ELISA技术检测各组IL-1α、IL-lβ含量，并进行比较。通过Western-blotting检测急性排斥反应期及排斥反应后期各组血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、色素上皮层衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)在角膜中的表达水平。结果 1.阴性对照组角膜新生血管(Corneal Neovascular，CNV)出现时间平均为2.37+0.44d，0.5％汉防己甲素滴眼液治疗组及O.1％地电塞米松滴眼液治疗组CNV出现时间分别为3.54±0.5ld和3.82±0.73d，联合用药组CNV出现时间平均为4.49±0.63d，与阴性对照组相比均存在显著性差异(p＜0.05)。实验观察期间各时间点Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组CNV生长速度均明显低于阴性对照组(P＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ组间比较无显著性差异(P＞0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间比较，Ⅳ组CNV生长速度明显低于Ⅱ组、Ⅲ组(P＜0.05)。2.角膜组织病理切片HE染色结果显示，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组角膜基质水肿、淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润程度均轻于阴性对照组(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组问比较，Ⅳ组角膜基质水肿、淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润程度最轻(P＜0.01)。角膜植片与植床交界手术缝线处可见密集巨噬细胞浸润。3.各组在角膜移植免疫排斥反应发生后TGF-βl、ICAM-1、RANTES、b-FGF、NF-kB的表达水平均明显增高，但各组表达强度有所差异，阴性对照组为强阳性表达(+++)，而Ⅱ、Ⅲ组表现为弱至中度阳性(+～++)，Ⅳ组则表现为弱阳性(±～+)。4.术后植片IL-1α、IL-lβ含量检测结果显示，各期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组角膜IL-1α、IL-lβ含量均明显低于阴性对照组(P＜O.01)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间比较，排斥反应前期Ⅱ组略高于Ⅲ组，但在排斥反应期及排斥反应后期两组角膜IL-1α、IL-lβ含量则无显著性差异(P＞0.05)，在整个实验观察过程中Ⅳ组IL-1α、IL-1β含量明显低于Ⅱ、Ⅲ组(P＜0.01)。5.蛋白免疫印迹检测植片VEGF、PEDF表达，各组急性排斥反应期VEGF表达强度最高，而PEDF表达量最低，整个观察过程中阴性对照组VEGF表达量明显高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，并有显著性差异(P＜O.01)，阴性对照组PEDF表达量则明显低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，差异有显著性(P＜0.01)。随着观察时间的延长VEGF表达量逐渐下降，PEDF表达量逐渐增高。各组PEDF/VEGF比值在急性排斥反应期为最低，随后比值逐渐增高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组PEDF/VEGF比值明显高于阴性对照组，差异有显著性(P＜O.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间比较，Ⅱ组急性排斥反应期VEGF表达量略高于Ⅲ组，而PEDF表达量及PEDF／VEGF比值则低于Ⅲ组(P<0.05)。