原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种临床最为常见的恶性肿瘤。随着肝脏外科技术的发展,肝癌的手术切除率不断提高,但其术后转移复发率仍居高不下,导致其整体疗效仍无显著改善。因此,肝癌术后的转移复发已成为严重制约提高肝癌长期生存率的主要障碍。深入研究肝癌高侵袭转移,有助于弄清肝癌复发转移的的分子机制。探索有效的预防和治疗复发转移的手段是肝癌研究领域中的重要科学问题,对于进一步提高肝癌患者术后整体治疗水平具有重要意义。嵌合体眼状蛋白1(Yurt/Mosaic eyes-like1, YMO1),又名EPB41L5,是新近发现的与胚胎原肠胚发育的蛋白,广泛表达于哺乳动物胚胎中、内胚层上皮组织。鉴于其具有调节细胞肌动蛋白骨架,调节细胞粘附分子,基底膜形成及细胞极性等功能,且在胚胎中的定位与成体肝脏一致,提示YMO1可能参与了肝癌侵袭转移过程。因此,本课题在研究YMO1在肝癌组织样本及肝癌细胞系中表达情况的基础上,结合临床随访病例分析YMO1与预后的关系,并通过构建YMO1过表达质粒,在细胞系中上调YMO1的表达,综合运用一系列功能学方法从体外和体内两个层面研究了YMO1调控HCC侵袭转移的分子机制,同时探讨YMO1抑制HCC侵袭转移的分子机制。我们研究结果显示：1、YMO1mRNA和蛋白在HCC组织中均呈低表达：首先我们在前期的预实验中,采用实时定量PCR对30例肝癌组织及相应癌旁组织对4.1蛋白家族的7个成员4.1R(EPB41)、4.1N(EPB41L1)、4.1G(EPB41L2)、41B(EPB41L3)、NBL4(EPB41L4A)、 EHM2(EPB41L4B)、YMO1(EPB41L5)的mRNA的表达水平进行定量检测。结果显示YMO1在肝癌组织中的表达下调。我们采用RT-PCR、 Realtime PCR和Western blot等方法检测了30例新鲜肝癌组织及相应的邻近非癌肝组织以及6例正常肝组织中YMO1mRNA和蛋白的表达水平,结果发现YMO1mRNA和蛋白在肝癌组织中表达明显低于邻近非癌肝组织。孤立性大肝癌(SLHCC)和小肝癌(SHCC)中的YMO1mRNA和蛋白表达水平明显高于结节性肝癌(NHCC)继之又采用RT-PCR及Western blot检测正常肝细胞L02细胞系及HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3四种侵袭转移潜能依次升高的肝癌细胞系中的YMO1mRNA和蛋白的表达水平,结果显示YMO1mRNA和蛋白在L02细胞系中显著高于其他肝癌细胞系；且其表达水平在HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3细胞中依次降低,提示YMO1的低表达与肝癌细胞的侵袭转移潜能密切相关。2、YMO1低表达与肝癌临床病理特征及预后的关系：我们采用免疫组化法检测155例HCC组织中YMO1的表达,结果显示YMO1主要分布于胞浆内及胞膜,肝癌组织中YMO1蛋白阳性表达率(63/155,40.6%)明显低于邻近非癌肝组织(131/155,84.5%),且其表达水平与肝癌结节个数、有无包膜及有无静脉浸润等临床病理特征相关。同时,YMO1低表达组的无瘤生存时间及总体生存时间均明显短于YMO1高表达组。多因素分析显示YMO1低表达与结节数目和静脉浸润是预测肝癌预后的独立危险因素,提示YMO1的低表达预示肝癌患者不良预后。3、YMO1在体外能显著抑制肝癌细胞的迁移运动能力而不影响肝癌细胞的增殖：我们构建了pcDNA3-YMO1过表达质粒,使用Lipofactamine LTX转染HCCLM3细胞系。经过G418筛选获得了稳定表达YMO1细胞系HCCLM3YMO1+和空质粒对照组HCCLM3vector细胞,并采用RT-PCR和Western blot方法验证YMO1的表达效率。划痕愈合实验结果显示HCCLM3YMO1+迁移运动能力较HCCLM3vector细胞明显减弱；Transwell实验结果进一步显示HCCLM3YMO1+细胞侵袭能力较HCCLM3vector细胞的明显下降；HCCLM3YMO1+细胞的同质性粘附能力较HCCLM3vector细胞明显增强而异质性粘附能力明显减弱。而细胞生长曲线结果则显示HCCLM3YMO1+与HCCLM3vector细胞的增殖能力无明显区别,表明上调YMO1的表达可显著抑制肝癌细胞的侵袭运动能力而对其增殖能力并无影响。4、YMO1能抑制肝癌的体内成瘤能力并降低肝内与肺转移率：我们建立了人肝癌细胞裸鼠皮下成瘤模型及人肝癌细胞裸鼠肝脏原位种植瘤模型,旨在体内进一步验证YMO1的功能。结果显示,HCCLM3YMO1+组皮下种植瘤成瘤率和肿瘤大小均小于HCCLM3vector组；原位肝脏种植瘤的平均直径HCCLM3YMO1+组明显小于HCCLM3vector组,且其肝内转移率和肺转移率明显降低,由此清楚地表明上调YMO1后不但在体内能够明显抑制肝癌细胞的成瘤能力,而且其侵袭转移能力也受到明显抑制。5、YMO1通过下调RhoC抑制肝癌侵袭转移：已有研究显示YMO1蛋白含有一个可以调控G蛋白磷酸化过程的PDZ结构域。鉴于RhoGTP酶家族蛋白是通过参与G蛋白磷酸化来影响细胞迁移运动,我们选取了一系列经典的RhoGTP酶分子进行免疫共沉淀筛选。结果显示,在我们选取的一系列RhoGTP酶分子中,HCCLM3YMO1+细胞中的RhoC和YMO1蛋白有共沉淀,提示YMO1与RhoC存在直接的相互作用。接着在过表达YMO1的HCCLM3YMO1+细胞系中转染pEGFP-C1-RhoC过表达质粒,以HCCLM3YMO1+和HCCLM3vector作为对照,采用Western blot检测了RhoC蛋白的表达水平,pulldown实验检测RhoC的GTP酶活性,划痕愈合实验检测迁移运动能力, Transwell实验检测侵袭能力,免疫荧光检测细胞骨架。结果显示,HCCLM3细胞系在转染pcDNA3-YMO1后,RhoC蛋白表达水平及GTP酶活性明显下降,侵袭及运动迁移能力减弱,细胞骨架趋于规整。而共转染pcDNA3-YMO1与pEGFP-C1-RhoC过表达质粒组与HCCLM3vector细胞系组无区别。结果明显提示,YMO1是通过抑制调控RhoC活性来抑制肝癌的侵袭转移。用Western blot检测ROCK1、PTEN、AKT、FAK、、ERK1/2的蛋白表达和蛋白磷酸化水平,结果显示,HCCLM3YMO1+细胞中,ROCK1的表达以及p-PTEN、p-AKT、p-FAK和p-ERK磷酸化水平明显下调,PTEN、AKT、FAK、ERK1/2的蛋白表达在HCCLM3vector细胞系、HCCLM3YMO1+细胞系以及HCCLM3YMO1+RhoC三组细胞系中均无明显差别。6.YMO1在肝癌中的表达受转录因子PAX5调控：我们利用SABiosciences的DECODE转录因子数据库对YMO1的启动子序列进行分析,推测PAX5可能是调控YMO1表达的上游转录因子。我们通过双荧光素酶报告基因系统、染色质免疫共沉淀技术(ChIP)以及Western blot等方法进行验证,结果证实,转录因子PAX5可以与YMO1的启动子序列的直接结合,并且PAX5对于YMO1的表达有上调作用。进一步通过对155例免疫组化的分析,证明在肝癌组织中YMO1与PAX5均呈低表达,且二者的表达水平呈正相关；而YMO1在肝癌组织中呈低表达,RhoC则呈高表达,呈显著的负相关。由此我们得出以下结论：YMO1在肝癌组织中及肝癌细胞系中呈低表达,其表达水平与肿瘤结节数目、有无包膜和静脉浸润等HCC临床病理特征密切相关,并显著影响肝癌患者的预后。上调YMO1的表达可在体外及体内显著抑制肝癌的侵袭转移,其作用是通过调控RhoC的蛋白表达及活性来实现的。本研究尚证实YMO1是一个潜在的肝癌转移抑制基因和预后标志物。