目的干眼是一种伴随泪液渗透压增高和眼表炎症的泪液和眼表多因素疾病,通常引起眼部不适、视觉障碍和泪膜不稳定,影响患者视力及生活质量。本研究旨在建立氢溴酸东莨菪碱诱导的泪液分泌不足型大鼠干眼模型,探索α-MSH对大鼠干眼眼表的保护作用及信号转导机制,运用QAH-DED-1蛋白芯片技术检测角结膜组织中与干眼相关的因子在蛋白水平上的变化。在角膜上皮细胞中确定α-MSH是否对苯扎氯铵刺激角膜上皮细胞具有保护作用和其机制。进一步了解α-MSH在不同生理作用下的个性特点以及共性通路,明确其对干眼眼表保护的作用机制,为研究干眼的发病机制和药物作用的靶点、设计和研制药物或干预措施提供理论依据。方法1、腹腔注射氢溴酸东莨菪碱建立泪液分泌不足型大鼠干眼模型。运用α-MSH给予局部治疗,通过各项临床指标的检测、组织病理学检测等方法,探索α-MSH对大鼠干眼眼表的保护作用。并与临床常用干眼治疗药物羧甲基纤维素钠联合,观察、检测及对比两者对干眼眼表的保护作用。2、运用H89、PD98059分别阻断PKA-CREB和MEK-Erk两条信号通路,再局部应用α-MSH,结合各时间点干眼临床指标,并通过组织石蜡切片染色、Western Blot等实验,进一步深入研究α-MSH在改善干眼症状的作用中的信号转导机制。3、运用QAH-DED-1蛋白芯片技术检测角结膜组织中的42个与干眼相关因子的蛋白水平,针对变化最为显著的EGFR因子进行细胞实验。运用苯扎氯铵刺激人角膜上皮细胞,模拟干眼眼表的炎症及氧化应激状态。并运用α-MSH处理细胞,通过检测细胞活性、细胞凋亡及细胞迁移能力,确定α-MSH是否对苯扎氯铵刺激角膜上皮细胞有保护作用。并运用EGFR抑制剂阻断EGF/EGFR信号通路,确定α-MSH是否仍具有对细胞的保护作用,明确α-MSH对角膜细胞保护作用的机制。结果1、腹部皮下注射氢溴酸东莨菪碱可成功引起大鼠眼表泪膜破裂时间缩短、泪液分泌量下降及角膜上皮完整性的破坏,同时引起角膜上皮增生、水肿,结膜杯状细胞萎缩、数量减少等干眼症状。α-MSH的局部应用可有效防止干眼大鼠泪液分泌量的减少,延长泪膜破裂时间,维持泪膜稳定性;保护角膜上皮完整性,改善角膜各层细胞结构,减轻角膜水肿情况;对结膜杯状细胞具有保护作用,防止杯状细胞的萎缩和减少。与羧甲基纤维素钠相比,α-MSH在泪膜稳定性和角膜上皮完整性方面凸显出一定的优势。2、α-MSH在氢溴酸东莨菪碱诱导的大鼠干眼模型中具有改善眼表功能、抗炎、形态维持、抗凋亡和细胞保护的作用。同时在保护眼表的过程中,α-MSH激活了大鼠干眼眼表组织中的PKA-CREB和MEK-Erk两条信号通路。通过特异性药理学阻断剂阻断任一途径均可消除α-MSH对眼表的保护作用。其中,PKA-CREB信号通路为主要途径,MEK-Erk为辅助性信号通路。两条信号通路的相互作用,共同支持α-MSH对干眼眼表的保护作用。3、EGFR的蛋白含量在干眼状态下明显下调,而α-MSH提高了 EGFR的蛋白水平。同时,α-MSH能够保护HCE细胞免于苯扎氯铵的破坏,具有维持HCE细胞活性、迁移能力和抗细胞凋亡的作用。用EGFR抑制剂Erlotinib-HCl阻断HCE细胞EGFR通路后,清除了 α-MSH对HCE细胞的保护作用,说明了 α-MSH对角膜上皮细胞的保护作用是通过EGF/EGFR系统得以实现。结论α-MSH可有效保护乙酰胆碱受体阻断剂氢溴酸东莨菪碱诱导的泪液分泌不足型大鼠干眼模型的眼表状态,增加泪液分泌量,延长泪膜破裂时间,维持泪膜稳定性和角膜上皮完整性;改善角膜各层细胞结构,减轻角膜水肿情况;防止结膜杯状细胞的萎缩和减少。与羧甲基纤维素钠相比,α-MSH在泪膜稳定性和角膜上皮完整性方面凸显出一定的优势。α-MSH激活了大鼠干眼眼表组织中的PKA-CREB和MEK-Erk两条信号通路,并上调了 EGFR的蛋白水平。两条信号通路的直接和间接相互作用,共同支持α-MSH对干眼眼表的保护作用。同时,α-MSH具有维持HCE细胞活性、迁移能力和抗细胞凋亡的作用,并且该作用是通过EGF/EGFR系统得以实现。